AtT-20小(xiao)鼠垂(chui)體瘤(liu)細(xi)胞培(pei)養(yang)步驟

AtT-20小鼠垂(chui)體瘤(liu)細(xi)胞培(pei)養(yang)步驟：

1）復(fu)蘇細(xi)胞：將含(han)有(you)1mL細胞懸(xuan)液的凍(dong)存(cun)管(guan)在(zai)37℃水(shui)浴中迅速搖晃(huang)解(jie)凍，加入(ru)5mL培養基(ji)混(hun)合均勻(yun)。在(zai)1000RPM條(tiao)件下離心5分鐘(zhong)，棄(qi)去上(shang)清(qing)液，補(bu)加4-6mL*培(pei)養基後(hou)吹(chui)勻(yun)。然(ran)後(hou)將所有細胞懸(xuan)液加入(ru)培養瓶中培養(yang)過(guo)夜(ye)（或將細(xi)胞懸(xuan)液加入(ru)6cm皿中），培養(yang)過(guo)夜(ye)。第二(er)天換(huan)液並檢(jian)查細胞密度。

2）細(xi)胞傳代：如(ru)果細(xi)胞密度達(da)80%-90%，即(ji)可進行傳代培養(yang)。

1、對於貼壁細(xi)胞，傳代可參(can)考以(yi)下方法(fa)：

1. 棄(qi)去培養(yang)上(shang)清(qing)，用不(bu)含鈣(gai)、鎂(mei)離(li)子(zi)的PBS潤(run)洗細(xi)胞1-2次。

2. 加1-2ml消化(hua)液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）於培養(yang)瓶中，置於37℃培養(yang)箱(xiang)中消化(hua)1-2min，然(ran)後(hou)在(zai)顯微(wei)鏡(jing)下觀察細胞消化(hua)情(qing)況(kuang)，若(ruo)細(xi)胞大部(bu)分變(bian)圓並脫落，迅速拿回操(cao)作(zuo)臺(tai)，輕敲幾(ji)下培養瓶後加5ml以(yi)上(shang)含(han)10%血(xue)清的*培(pei)養(yang)基(ji)終止(zhi)消化(hua)。

3.輕(qing)輕吹(chui)打(da)細胞，*脫落後吸(xi)出(chu)，在(zai)1000RPM條(tiao)件下離心8-10分鐘(zhong)，棄(qi)去上(shang)清(qing)液，補(bu)加1-2mL培(pei)養液後吹(chui)勻(yun)。

4. 按5-6ml/瓶補(bu)加培(pei)養液，將細(xi)胞懸(xuan)液按1：2到(dao)1：5的比(bi)例分到(dao)新的(de)含(han)5-6 ml培(pei)養液的新(xin)皿中或者瓶中。

2、對於懸浮(fu)細(xi)胞，傳代可參(can)考以(yi)下方法(fa)：

方法(fa)壹：收集(ji)細胞，1000RPM條(tiao)件下離心8-10分鐘(zhong)，棄(qi)上(shang)清(qing)液，補(bu)加1-2ml培(pei)養液後吹(chui)勻(yun)，將細(xi)胞懸(xuan)液按1:2到(dao)1:5的比(bi)例分到(dao)新的(de)含(han)8ml培(pei)養基的(de)新皿(min)中或瓶中。

方法(fa)三(san)：可選(xuan)擇半(ban)數換液方式，棄(qi)半(ban)數培養(yang)基後(hou)，將剩(sheng)余(yu)細胞懸(xuan)起，將細(xi)胞懸(xuan)液按1:2到(dao)1:3的比(bi)例分到(dao)新的(de)含(han)8ml培(pei)養基新(xin)皿中或者瓶中。

1）細胞凍(dong)存(cun)：待(dai)細胞生(sheng)長(chang)狀態良好(hao)時，可進行細胞凍(dong)存(cun)。棄(qi)培(pei)養(yang)基(ji)後(hou)加入(ru)少(shao)量胰mei，細胞變(bian)圓(yuan)脫落後，進行離心(xin)收集(ji)，1000RPM條(tiao)件下離心8-10分鐘(zhong)，去除(chu)上(shang)清(qing)，按凍存(cun)數量加入(ru)到(dao)凍存(cun)液中。