鼠抗人骨(gu)形成蛋(dan)白(bai)4單(dan)克(ke)隆抗體(ti)原(yuan)理

壹、 原(yuan)理

與(yu)Southern或Northern雜(za)交方法(fa)類(lei)似，但Western Blot采(cai)用的(de)是聚(ju)丙(bing)烯酰(xian)胺凝(ning)膠電泳，被檢(jian)測物(wu)是蛋(dan)白(bai)質(zhi)，“探(tan)針(zhen)"是抗(kang)體(ti)，“顯(xian)色(se)"用(yong)標(biao)記(ji)的二抗。經過(guo)PAGE分離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣品，轉移(yi)到(dao)固(gu)相(xiang)載體(ti)（例(li)如(ru)硝(xiao)#纖(xian)維素(su)薄膜(mo)）上，固(gu)相(xiang)載體(ti)以非(fei)共(gong)價(jia)鍵(jian)形式吸(xi)附(fu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)，且(qie)能(neng)保持(chi)電泳分(fen)離(li)的(de)多(duo)肽類(lei)型(xing)及其(qi)生(sheng)物(wu)學(xue)活性不(bu)變(bian)。以固(gu)相(xiang)載體(ti)上(shang)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)或多(duo)肽作(zuo)為(wei)抗(kang)原(yuan)，與(yu)對(dui)應(ying)的抗(kang)體(ti)起(qi)免(mian)疫(yi)反(fan)應，再(zai)與(yu)酶(mei)或同位素(su)標(biao)記(ji)的第二(er)抗體(ti)起(qi)反(fan)應，經(jing)過(guo)底物顯色(se)或放(fang)射自(zi)顯影(ying)以檢(jian)測電泳分(fen)離(li)的(de)特(te)異性目(mu)的基(ji)因(yin)表達的(de)蛋(dan)白(bai)成分。該技(ji)術也廣(guang)泛(fan)應(ying)用(yong)於(yu)檢(jian)測蛋(dan)白(bai)水(shui)平(ping)的表達。

二(er)、分類(lei)

現常用(yong)的(de)有(you)底物化學(xue)發光ECL和(he)底物DAB呈(cheng)色(se)，體(ti)同水平(ping)和(he)實(shi)驗條(tiao)件的(de)是用(yong)*種(zhong)方法(fa)，目(mu)前發表文章(zhang)通常是用(yong)底物化學(xue)發光ECL。只要買現成的試劑盒就行，操作(zuo)也比較(jiao)簡(jian)單(dan)，原(yuan)理如下(xia)（二(er)抗用(yong)HRP標記(ji)）：反(fan)應底物為過(guo)氧化物+魯(lu)米(mi)諾(nuo)，如(ru)遇(yu)到(dao)HRP，即(ji)發光，可使(shi)膠片(pian)曝(pu)光，就可洗(xi)出條(tiao)帶。

三、主(zhu)要(yao)試劑鼠抗(kang)人骨(gu)形成蛋(dan)白(bai)4單(dan)克(ke)隆抗體(ti)    Bone Morphogenetic Protein 4 、 丙(bing)烯酰(xian)胺和(he)N，N’-亞甲(jia)雙丙(bing)烯酰(xian)胺，應(ying)以溫(wen)熱(re)（以利(li)於溶(rong)解雙丙稀酰(xian)胺）的(de)去(qu)離子(zi)水(shui)配(pei)制(zhi)含有(you)29%（w/v）丙(bing)稀酰(xian)胺和(he)%（w/v）N，N’-亞甲(jia)雙丙(bing)烯酰(xian)胺儲(chu)存(cun)液丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺29g，N，N-亞甲(jia)叉(cha)雙(shuang)丙稀(xi)酰(xian)胺g，加(jia)H2O至 00ml。）儲於棕(zong)色(se)瓶(ping)，4℃避光(guang)保存(cun)。嚴(yan)格(ge)核實(shi)PH不(bu)得(de)超(chao)過(guo)7.0，因可以發生脫氨基(ji)反(fan)應是光(guang)催化或堿(jian)催化的(de)。使(shi)用期(qi)不(bu)得(de)超(chao)過(guo)兩個月，隔幾(ji)個月須(xu)重新配(pei)制(zhi)。如(ru)有(you)沈(chen)澱，可以過(guo)濾(lv)。

2、 十(shi)二烷基硫(liu)#鈉(na)SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離子(zi)水(shui)配(pei)制(zhi)，室溫(wen)保存(cun)。

3、 分離(li)膠緩沖(chong)液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混(hun)合(he)，加(jia)水稀釋到(dao)兔(tu)    Bone Morphogenetic Protein 4   4、 濃縮膠緩沖(chong)液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於40mlH2O中(zhong)，用約48ml mol/L HCl調至(zhi)pH6.8加(jia)水稀(xi)釋到(dao)00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過(guo)濾(lv)後(hou)40C保存(cun)。這兩(liang)種(zhong)緩沖(chong)液(ye)必(bi)須(xu)使用(yong)Tris堿(jian)制(zhi)備(bei)，再(zai)用HCL調節(jie)PH值，而(er)不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液(ye)N，N，N’N’四甲基乙二(er)胺催化過(guo)硫(liu)#銨形成自(zi)由(you)基(ji)而(er)加速(su)兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺的(de)聚合。PH太低(di)時，聚(ju)合(he)反(fan)應受(shou)到抑(yi)制。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺溶(rong)液。提供(gong)兩種(zhong)丙稀(xi)酰(xian)胺聚(ju)合所必(bi)須(xu)的自(zi)由(you)基(ji)。去(qu)離子(zi)水(shui)配(pei)制(zhi)數ml，臨(lin)用(yong)前配(pei)制(zhi).

6、 SDS- PAGE加(jia)樣緩沖(chong)液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液(ye)8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍.6ml，H2O 32ml混(hun)勻備(bei)用(yong)。按:或:2比(bi)例與(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣品混(hun)合(he)，在(zai)沸水終(zhong)煮(zhu)3min混(hun)勻後(hou)再上樣，壹般(ban)為(wei)20-25ul，總蛋(dan)白(bai)量00μg。

7、 Tris-甘氨(an)#電泳緩沖(chong)液(ye):30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用(yong)蒸餾水溶(rong)解(jie)至(zhi)000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極(ji)緩沖(chong)液(ye)。臨(lin)用(yong)前稀釋0倍(bei)。

8、 轉移(yi)緩沖(chong)液(ye)：配(pei)制(zhi)L轉移(yi)緩沖(chong)液(ye)，需稱(cheng)取(qu)2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加(jia)入200ml甲醇，加(jia)水至(zhi)總量L。

9、 麗春(chun)紅染液儲(chu)存(cun)液：麗(li)春(chun)紅S 2g 三#乙(yi)#30g 磺(huang)基(ji)水(shui)楊(yang)# 30g 加(jia)水(shui)至(zhi)00ml 用(yong)時上(shang)述(shu)儲存(cun)液稀(xi)釋0倍(bei)即(ji)成麗春(chun)紅S使(shi)用(yong)液(ye)。使用後(hou)應予(yu)以廢棄(qi)。

10、 脫脂(zhi)奶粉5%（w/v）。

11、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉(na)（有(you)毒(du)，戴手(shou)套(tao)操作(zuo)），溶(rong)於(yu)磷(lin)#緩沖(chong)鹽(yan)溶液（PBS）。

12、 Tris緩沖(chong)鹽(yan)溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

13、 Tween20（5）鼠(shu)抗人-MMP-9（6）鼠抗(kang)人(ren)-TIMP-。

14、 過(guo)氧化物酶(mei)標(biao)記(ji)的第二(er)抗體(ti)。

15、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二(er)甲(jia)基甲酰(xian)胺，75mg/ml）。

16、 BCIP（溶(rong)於00%二甲基(ji)甲(jia)酰(xian)胺，50mg/ml）。

17、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

18、 00mmol/L NaCl。

19、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L 公(gong)司(si)其(qi)他產品列(lie)表：Carmine 胭脂(zhi)紅 [390-65-4]