谷(gu)研試(shi)劑-細(xi)胞(bao)融合(he)

                                     谷(gu)研試(shi)劑-細(xi)胞(bao)融合(he)

細(xi)胞(bao)融合(he)的步驟：

    .制備(bei)飼(si)養(yang)細(xi)胞(bao)層(ceng)  壹(yi)般(ban)選擇小(xiao)鼠(shu)腹(fu)腔巨(ju)噬細(xi)胞(bao)。

與(yu)免(mian)疫小(xiao)鼠(shu)相(xiang)同(tong)晶(jing)系的小(xiao)鼠(shu)，常用(yong)BALB／C小(xiao)鼠(shu)，6～0周齡(ling)

↓

拉頸處死，浸(jin)泡(pao)在(zai)75％乙(yi)醇內(nei)，3～5min

↓

用(yong)無(wu)菌剪(jian)刀(dao)剪(jian)開(kai)皮膚(fu)，暴(bao)露腹(fu)膜

↓

用(yong)無(wu)菌註(zhu)射(she)器註入(ru)5～6ml預(yu)冷的培養(yang)液(嚴禁刺(ci)破腸(chang)管)

↓

反(fan)復沖洗(xi)，吸(xi)出沖(chong)洗(xi)液(ye)

↓

沖(chong)洗(xi)液(ye)放人0ml離(li)心(xin)管， 200r／min／分離(li)5～6min

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用(yong)20％小(xiao)牛(niu)血清(qing)或(huo)胎牛(niu)血清(qing)的培養(yang)液混懸，調(tiao)整細(xi)胞(bao)數(shu)至lXl0‘／ml

↓

加(jia)入96孔板(ban)，00ul/孔

↓

放人37℃C02孵(fu)箱(xiang)培養(yang)

    2．制備(bei)免(mian)疫脾(pi)細(xi)胞(bao)  

zui後(hou)壹(yi)次加(jia)強免(mian)疫3d後(hou)小(xiao)鼠(shu)拉(la)頸處死

↓

無(wu)菌取(qu)脾(pi)臟(zang)，培養(yang)液洗(xi)次

↓

脾臟(zang)研碎，過(guo)不(bu)銹鋼篩網

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離(li)心(xin)，細(xi)胞(bao)用(yong)培養(yang)液洗(xi)2次

↓

計數(shu)

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取脾淋(lin)巴細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)備(bei)用(yong)

    3．制備(bei)骨髓瘤(liu)細(xi)胞(bao)

般(ban)選用(yong)小(xiao)鼠(shu)腹(fu)

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取對(dui)數(shu)生骨髓瘤(liu)細(xi)胞(bao)離(li)心(xin)

↓

用(yong)無(wu)血清(qing)培養(yang)液洗(xi)2次

4.融合(he)

    ()將(jiang)骨髓瘤(liu)細(xi)胞(bao)與(yu)脾(pi)細(xi)胞(bao)按(an)：0或(huo)：5的比例混合在(zai)壹(yi)起(qi)，在(zai)50m離(li)心(xin)管中(zhong)用(yong)無(wu)血清(qing)不(bu)*培養(yang)液洗(xi)次，離(li)心(xin)，l 200r／min，8min；棄(qi)上清液(ye)，用(yong)吸(xi)管吸(xi)凈(jing)殘留(liu)液體，以免(mian)影響聚乙(yi)二(er)醇(PEG)濃(nong)度(du)。輕輕(qing)彈(dan)擊(ji)離(li)心(xin)管底，使細(xi)胞(bao)沈(chen)澱(dian)略(lve)松動。

    (2)90s內(nei)加(jia)入37℃預(yu)溫的m 45％PEG(分子(zi)量(liang)4 000)溶液，邊加(jia)邊輕(qing)搖(yao)。37℃水浴(yu)作用(yong)90s。

    (3)加(jia)37℃預(yu)溫的不(bu)*培養(yang)液以終(zhong)止(zhi)PEG作用(yong)，每(mei)隔(ge)2min分別(bie)加(jia)入lml、2ml、3ml、4ml、5ml和(he)6ml。

    (4)離(li)心(xin)，800r／rain，6min。

    (5)棄(qi)上清液(ye)，用(yong)含(han)20％小(xiao)牛(niu)血清(qing)HAT選(xuan)擇培養(yang)液重懸(xuan)。

    (6)將(jiang)上述細(xi)胞(bao)，加(jia)到已有飼養(yang)細(xi)胞(bao)層(ceng)的96孑L板(ban)內(nei)，每孔加(jia)00tzl。壹(yi)般(ban)個免(mian)疫脾(pi)臟(zang)可接(jie)種(zhong)4塊96孔板(ban)。

    (7)將(jiang)培養(yang)板(ban)置37℃、5％CO：培養(yang)箱(xiang)中(zhong)培養(yang)。

    細(xi)胞(bao)融合(he)是(shi)雜(za)交瘤(liu)技(ji)術(shu)的中(zhong)心(xin)環節(jie)，基本(ben)步驟是將(jiang)兩種細(xi)胞(bao)混合後(hou)加(jia)入PEG使細(xi)胞(bao)彼(bi)此(ci)融合(he)。然(ran)後(hou)用(yong)培養(yang)液稀釋PEG，消(xiao)除(chu)PEG的作用(yong)。將(jiang)融合(he)後(hou)的細(xi)胞(bao)適當稀(xi)釋，分置培養(yang)板(ban)孔中(zhong)培養(yang)。融合(he)過(guo)程中(zhong)有3個問題(ti)應(ying)特(te)別(bie)註意，①細(xi)胞(bao)比例，骨髓瘤(liu)細(xi)胞(bao)與(yu)脾(pi)細(xi)胞(bao)的比值可從：2到(dao)：0不(bu)等(deng)，常用(yong)：4的比例。應(ying)保(bao)證(zheng)兩種細(xi)胞(bao)在(zai)融合(he)前都具有較高活性。②反應(ying)時(shi)間，在(zai)兩種(zhong)細(xi)胞(bao)的混合細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)中(zhong)，第(di)分鐘(zhong)滴加(jia)4。5ml培養(yang)液；間隔(ge)2rain滴加(jia)5ml培養(yang)液，然後(hou)加(jia)培養(yang)液50ml。③培養(yang)液的成分，良(liang)好的培養(yang)液對融合(he)細(xi)胞(bao)尤(you)其(qi)重(zhong)要(yao)，其(qi)中(zhong)的小(xiao)牛(niu)血清(qing)、各種離(li)子(zi)和(he)營養(yang)成分均需(xu)嚴格配制。如融合(he)效(xiao)率降(jiang)低，應(ying)隨時核查培養(yang)基情況(kuang)。