白(bai)介(jie)素(su)8ELISA的(de)實驗技術(shu)方(fang)法

白介素(su)8ELISA的(de)實驗技術(shu)方(fang)法

    白(bai)介(jie)素(su)Il-8是壹種分(fen)子量為8～0kD的(de)多肽(tai)，對(dui)嗜中(zhong)性(xing)粒(li)細(xi)胞(bao)，T淋(lin)巴(ba)細胞(bao)、嗜(shi)鹼(jian)性(xing)粒(li)細(xi)胞(bao)具有(you)趨化(hua)作(zuo)用(yong)，並(bing)可(ke)激活嗜中(zhong)性(xing)粒(li)細(xi)胞(bao)，是壹種重(zhong)要(yao)的(de)炎癥介(jie)質(zhi)。在嚴(yan)重感(gan)染(ran)病(bing)人(ren)的(de)血(xue)清中(zhong)、炎(yan)癥局(ju)部(bu)滲出(chu)液中(zhong)都(dou)可(ke)檢(jian)測到(dao)高(gao)水(shui)平的(de)IL-8。此外，近年(nian)來的研究表(biao)明(ming)，白(bai)介素(su)Il-8可(ke)能與各(ge)種組(zu)織缺血(xue)後再灌註(zhu)損(sun)傷(shang)的發(fa)生(sheng)有關。研(yan)究人員(yuan)采用(yong)兩株(zhu)自(zi)制的單(dan)克(ke)隆抗體建(jian)立了(le)夾心(xin)法ELISA用(yong)於(yu)檢(jian)測IL-8，敏(min)感(gan)性(xing)可(ke)達56Pg/ml。

相(xiang)關專題(ti)ELISA免(mian)疫(yi)實(shi)驗技術(shu)
    白(bai)介素(su)Il-8是壹種分(fen)子量為8～0kD的(de)多肽(tai)，對(dui)嗜中(zhong)性(xing)粒(li)細(xi)胞(bao)，T淋(lin)巴(ba)細胞(bao)、嗜(shi)鹼(jian)性(xing)粒(li)細(xi)胞(bao)具有(you)趨化(hua)作(zuo)用(yong)，並(bing)可(ke)激活嗜中(zhong)性(xing)粒(li)細(xi)胞(bao)，是壹種重(zhong)要(yao)的(de)炎癥介(jie)質(zhi)。在嚴(yan)重感(gan)染(ran)病(bing)人(ren)的(de)血(xue)清中(zhong)、炎(yan)癥局(ju)部(bu)滲出(chu)液中(zhong)都(dou)可(ke)檢(jian)測到(dao)高(gao)水(shui)平的(de)IL-8。此外，近年(nian)來的研究表(biao)明(ming)，白(bai)介素(su)Il-8可(ke)能與各(ge)種組(zu)織缺血(xue)後再灌註(zhu)損(sun)傷(shang)的發(fa)生(sheng)有關。我(wo)們采用(yong)兩株(zhu)自(zi)制的單(dan)克(ke)隆抗體建(jian)立了(le)夾心(xin)法ELISA用(yong)於(yu)檢(jian)測IL-8，敏(min)感(gan)性(xing)可(ke)達56Pg/ml，操(cao)作(zuo)簡(jian)單(dan)，重(zhong)復(fu)性(xing)良好(hao)，可(ke)用於(yu)IL-8的基(ji)礎和臨床研(yan)究。
壹、原理：
采用(yong)兩株(zhu)識(shi)別不同表(biao)位(wei)的抗IL-8單(dan)克(ke)隆抗體，其(qi)中(zhong)壹株(zhu)(4D7)作(zuo)為包被(bei)抗體，以(yi)識別(bie)和結(jie)合待檢(jian)標本(ben)中(zhong)的(de)白介(jie)素(su)Il-8,另(ling)壹株(zhu)作(zuo)為酶標抗體，與(yu)結(jie)合於包被(bei)抗體的(de)IL-8的(de)另(ling)壹個表位(wei)結(jie)合並催(cui)化(hua)底物顯(xian)色。
二、試劑器材(cai)
. 試(shi)劑盒提供(gong)包被(bei)抗體、酶標抗體、標(biao)準品，底物(ABTS)、96孔(kong)elisa板。
2. 包被(bei)緩沖(chong)液、PBS、底物緩(huan)沖(chong)液配制同(tong)常規(gui)ELISA法(fa)。
三(san)、操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou)：
. 包被(bei)：pH9.5 碳(tan)酸(suan)鹽(yan)緩液(ye)稀釋(shi)4D7單(dan)克(ke)隆抗體粗(cu)提γ球(qiu)蛋(dan)白至(zhi)μg/ml,加入96孔板,00μl/孔(kong)，放(fang)4℃,36小(xiao)時(shi)。
2. 封(feng)閉(bi)：0.%吐(tu)溫(wen)PBS(Buffer A)沖(chong)洗(xi)96孔(kong)板三(san)次(ci)，加3%BSA Buffer A(Buffer B)200μl/孔(kong)，放37℃,小(xiao)時(shi)。
3. 加待(dai)檢(jian)樣品(pin)：Buffer A 沖(chong)洗(xi)96孔(kong)板三(san)次(ci)，加待(dai)檢(jian)樣品(pin)及Buffer B 稀(xi)釋的標準品00μl/孔(kong)，放(fang)37℃,3小(xiao)時(shi)。
4. 加酶標抗體：Buffer A沖(chong)洗(xi)96孔(kong)板五(wu)次(ci),3%PEG Buffer A稀釋(shi)酶標抗體至(zhi)∶800，加入96孔板，00μl/孔(kong)，放(fang)37℃,小(xiao)時(shi)。
5. 顯(xian)色：Buffer A沖(chong)洗(xi)96孔(kong)板五(wu)次(ci)，pH5.4檸檬酸緩沖(chong)液溶(rong)解(jie)底物(ABTS),0.2mg/ml,加3%H2O2,2μl/ml，加入96孔板，00μ/孔(kong)，室(shi)溫(wen)下或37℃顯(xian)色。
四、註意事(shi)項：
. 待(dai)檢(jian)標本(ben)如為血(xue)清，應(ying)采用(yong)壹次(ci)性(xing)容(rong)器(qi)，血(xue)液(ye)采集後盡快(6小(xiao)時(shi)以(yi)內)分離(li)血(xue)清。
2. 封(feng)閉(bi)液或抗體稀(xi)釋(shi)液應(ying)新(xin)鮮配制或凍存。