兔內毒素（Endotoxins）ELISA試劑(ji)盒說(shuo)明書(shu)

兔(tu)內毒素（Endotoxins）ELISA試劑(ji)盒說(shuo)明書(shu)

本試劑(ji)僅(jin)供研(yan)究使用(yong)      標(biao)本(ben)：血清或血漿(jiang)

試驗(yan)原(yuan)理(li)：
兔(tu)內毒素Endotoxins試劑(ji)盒是固(gu)相(xiang)夾(jia)心(xin)法酶聯(lian)免(mian)疫吸(xi)附實(shi)驗(yan)（ELISA）.已知(zhi)Endotoxins濃(nong)度(du)的(de)標準(zhun)品(pin)、未(wei)知(zhi)濃(nong)度(du)的(de)樣(yang)品(pin)加入微(wei)孔酶標(biao)板(ban)內進行(xing)檢測(ce)。先(xian)將Endotoxins和標記(ji)的(de)抗(kang)體(ti)同時溫育(yu)。洗滌後，加入親和素標記(ji)過(guo)的HRP。再經(jing)過(guo)溫育(yu)和洗滌，去除未(wei)結合的酶結(jie)合(he)物(wu)，然後加入底(di)物(wu)A、B，和酶結(jie)合(he)物(wu)同時作(zuo)用(yong)。產(chan)生顏(yan)色。顏(yan)色的深(shen)淺和樣(yang)品(pin)中Endotoxins的濃(nong)度(du)呈(cheng)比例(li)關系。

試劑盒內容(rong)及其(qi)配(pei)制
試劑(ji)盒成份(fen)（2-8℃保(bao)存）    96孔配(pei)置(zhi)    48孔配(pei)置(zhi)    配制(zhi)
96/48人(ren)份酶標(biao)板(ban)    塊板(ban)（96T）    半塊板(ban)（48T）    即(ji)用(yong)型(xing)
塑(su)料膜(mo)板(ban)蓋    塊    半塊(kuai)    即(ji)用(yong)型(xing)
標(biao)準(zhun)品(pin)：80pg/ml    瓶（0.6ml）    瓶（0.3ml）    按說(shuo)明書(shu)進行稀(xi)稀(xi)
空白對照    瓶（.0ml）    瓶（0.5ml）    即(ji)用(yong)型(xing)
標(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)緩(huan)沖液(ye)    瓶（5ml）    瓶（2.5ml）    即(ji)用(yong)型(xing)
標(biao)記(ji)的(de)抗(kang)Endotoxins抗(kang)體    瓶（6ml）    瓶（3.0ml）    即(ji)用(yong)型(xing)
親和鏈(lian)酶素-HRP    瓶（0ml）    瓶（5.0ml）    即(ji)用(yong)型(xing)
洗(xi)滌緩(huan)沖液(ye)    瓶（20ml）    瓶（0ml）    按說(shuo)明書(shu)進行稀(xi)釋(shi)
底物(wu)A    瓶（6.0ml）    瓶（3.0ml）    即(ji)用(yong)型(xing)
底(di)物(wu)B    瓶（6.0ml）    瓶（3.0ml）    即(ji)用(yong)型(xing)
終(zhong)止液(ye)    瓶（6.0ml）    瓶（3.0ml）    即(ji)用(yong)型(xing)
標(biao)本稀(xi)釋(shi)液(ye)    瓶（2ml）    瓶（6.0ml）    即(ji)用(yong)型(xing)

兔(tu)內毒素Endotoxins自備(bei)材(cai)料(liao)
蒸餾(liu)水(shui)。
加樣(yang)器(qi)：5ul、0ul、50ul、00ul、200ul、500ul、000ul。
振蕩(dang)器及(ji)磁(ci)力(li)攪(jiao)拌(ban)器等。

安全(quan)性(xing)
避免(mian)直(zhi)接(jie)接(jie)觸(chu)終(zhong)止液(ye)和底物(wu)A、B。壹(yi)旦接(jie)觸(chu)到(dao)這些液(ye)體，請盡(jin)快(kuai)用(yong)水(shui)沖(chong)洗。
實驗(yan)中不要(yao)吃(chi)喝(he)、抽(chou)煙(yan)或使用(yong)化(hua)妝品(pin)。
不要(yao)用(yong)嘴(zui)吸(xi)取試(shi)劑(ji)盒裏(li)的任何(he)成(cheng)份。

操作(zuo)註(zhu)意事項(xiang)
試劑(ji)應(ying)按標簽(qian)說(shuo)明書(shu)儲存(cun)，使用(yong)前(qian)恢復到(dao)室溫。稀(xi)稀過(guo)後的(de)標準(zhun)品(pin)應(ying)丟棄(qi)，不可(ke)保(bao)存。
實(shi)驗(yan)中不用(yong)的(de)板(ban)條(tiao)應(ying)立即(ji)放(fang)回包(bao)裝袋中，密(mi)封(feng)保(bao)存，以免變質。
不用(yong)的(de)其(qi)它(ta)試劑(ji)應(ying)包裝(zhuang)好(hao)或蓋(gai)好(hao)。不同批(pi)號(hao)的(de)試劑不要(yao)混用(yong)。保(bao)質前(qian)使用(yong)。
使用(yong)壹(yi)次(ci)性(xing)的吸頭以免交叉汙(wu)染(ran)，吸(xi)取終(zhong)止(zhi)液(ye)和底物(wu)A、B液(ye)時，避免(mian)使用(yong)帶金屬(shu)部分的(de)加樣(yang)器(qi)。
使用(yong)幹(gan)凈(jing)的塑料容(rong)器配(pei)置(zhi)洗滌液(ye)。使用(yong)前(qian)充(chong)分混勻試(shi)劑盒裏(li)的各(ge)種成(cheng)份及樣(yang)品(pin)。
洗滌酶標(biao)板(ban)時應(ying)充分(fen)拍幹，不要(yao)將吸(xi)水(shui)紙直(zhi)接(jie)放(fang)入酶標(biao)反(fan)應(ying)孔中吸水(shui)。
底(di)物(wu)A應(ying)揮發(fa)，避免長時間打(da)開蓋子。底物(wu)B對光(guang)敏感(gan)，避(bi)免(mian)長時間暴露於(yu)光(guang)下。避(bi)免用(yong)手(shou)接(jie)觸(chu)，有(you)毒。實驗(yan)完(wan)成(cheng)後應(ying)立即(ji)讀(du)取OD值(zhi)。
加入試(shi)劑(ji)的(de)順(shun)序(xu)應(ying)壹(yi)致(zhi)，以保(bao)證所(suo)有(you)反(fan)應(ying)板(ban)孔溫育(yu)的時間壹(yi)樣(yang)。
按照說(shuo)明書(shu)中標明的(de)時間、加液(ye)的量及(ji)順(shun)序(xu)進(jin)行(xing)溫育(yu)操作(zuo)。

兔(tu)內毒素Endotoxins樣(yang)品(pin)收集(ji)、處理(li)及(ji)保(bao)存方(fang)法
血清-----操作(zuo)過(guo)程中避免(mian)任何(he)細胞刺激(ji)。使用(yong)不含(han)熱原(yuan)和內毒素的試(shi)管(guan)。收(shou)集(ji)血液(ye)後，000×g離(li)心(xin)0分鐘將血清和紅細胞迅速小(xiao)心(xin)地分離(li)。
血漿(jiang)-----EDTA、檸(ning)檬酸(suan)鹽(yan)、肝素血漿(jiang)可(ke)用(yong)於(yu)檢測(ce)。000×g離(li)心(xin)30分鐘去除顆(ke)粒。
細胞上(shang)清液(ye)---000×g離心(xin)0分鐘去除顆(ke)粒和聚合物(wu)。
組織勻漿(jiang)-----將組(zu)織加入適(shi)量(liang)生理(li)鹽(yan)水(shui)搗(dao)碎(sui)。000×g離(li)心(xin)0分鐘，取上(shang)清液(ye)
保(bao)存------如果樣(yang)品(pin)不立即(ji)使用(yong)，應(ying)將其(qi)分(fen)成小(xiao)部(bu)分-70 ℃保(bao)存，避(bi)免(mian)反(fan)復冷(leng)凍(dong)。盡(jin)可(ke)能的不要(yao)使用(yong)溶(rong)血或高血脂(zhi)血。如果血清中大(da)量顆(ke)粒，檢測(ce)前(qian)先(xian)離(li)心(xin)或過(guo)濾。不要(yao)在37℃或更(geng)高的(de)溫度(du)加熱解(jie)凍(dong)。應(ying)在室溫下(xia)解(jie)凍(dong)並(bing)確(que)保(bao)樣(yang)品(pin)均勻地(di)充分(fen)解(jie)凍(dong)。

試(shi)劑的準(zhun)備
標(biao)準(zhun)品(pin)：標準(zhun)品(pin)的系列稀釋應(ying)在實驗(yan)時準(zhun)備，不能儲存(cun)。稀釋(shi)前(qian)將標(biao)準(zhun)品(pin)振蕩(dang)混勻。稀(xi)釋比(bi)例(li)按下表中進行(xing)：
80 pg/ml    （6號(hao)標(biao)準(zhun)品(pin)）    原(yuan)倍濃(nong)度(du)不用(yong)稀(xi)釋(shi)直接(jie)加入50ul。
40 pg/ml    （5號(hao)標(biao)準(zhun)品(pin)）    00ul的原(yuan)倍標(biao)準(zhun)品(pin)加入00ul的(de)標(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液(ye)
20 pg/ml    （4號(hao)標(biao)準(zhun)品(pin)）    00ul的5號(hao)標(biao)準(zhun)品(pin)加入00ul的(de)標(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液(ye)
0 pg/ml    （3號(hao)標(biao)準(zhun)品(pin)）    00ul的4號(hao)標(biao)準(zhun)品(pin)加入00ul的(de)標(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液(ye)
5.0 pg/ml    （2號(hao)標(biao)準(zhun)品(pin)）    00ul的3號(hao)標(biao)準(zhun)品(pin)加入00ul的(de)標(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液(ye)
2.5 pg/ml    （號(hao)標(biao)準(zhun)品(pin)）    00ul的2號(hao)標(biao)準(zhun)品(pin)加入00ul的(de)標(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液(ye)
0 pg/ml    （空白對照）    原(yuan)始濃(nong)度(du)不用(yong)稀(xi)釋(shi)直接(jie)加入50ul。

洗(xi)滌緩(huan)沖液(ye)（50×）的稀釋(shi)：蒸餾(liu)水(shui)50倍稀(xi)釋。

兔內毒素Endotoxins操作(zuo)步(bu)驟
使用(yong)前(qian)，將所(suo)有(you)試(shi)劑(ji)充(chong)分混勻。不要(yao)使液(ye)體產生大(da)量的(de)泡沫，以免加樣(yang)時加入大(da)量的(de)氣泡，產(chan)生加樣(yang)上(shang)的(de)誤差(cha)。
根據待(dai)測(ce)樣(yang)品(pin)數量(liang)加上(shang)標(biao)準(zhun)品(pin)的數(shu)量決定(ding)所需的板(ban)條(tiao)數(shu)。每(mei)個標準(zhun)品(pin)和空白孔建議(yi)做(zuo)復孔。每(mei)個樣(yang)品(pin)根據自(zi)己(ji)的數(shu)量來定(ding)，能使用(yong)復孔的(de)盡(jin)量(liang)做(zuo)復孔。標(biao)本用(yong)標(biao)本(ben)稀釋液(ye)：稀釋後加入50ul於(yu)反(fan)應(ying)孔內。
加入稀(xi)釋(shi)好(hao)後的(de)標準(zhun)品(pin)50ul於(yu)反(fan)應(ying)孔、加入待(dai)測(ce)樣(yang)品(pin)50ul於(yu)反(fan)應(ying)孔內。立即(ji)加入50ul的(de)標(biao)記(ji)的(de)抗(kang)體(ti)。蓋上(shang)膜(mo)板(ban)，輕輕振蕩(dang)混勻，37℃溫育(yu)小(xiao)時。
甩去孔內液(ye)體，每(mei)孔加滿洗(xi)滌液(ye)，振蕩(dang)30秒，甩去洗滌液(ye)，用(yong)吸(xi)水(shui)紙拍幹。重(zhong)復此操作(zuo)3次(ci)。如果用(yong)洗(xi)板(ban)機(ji)洗(xi)滌，洗滌次數增加壹(yi)次(ci)。
每(mei)孔加入80ul的(de)親和鏈(lian)酶素-HRP，輕輕(qing)振(zhen)蕩(dang)混勻，37℃溫育(yu)30分鐘。
甩去孔內液(ye)體，每(mei)孔加滿洗(xi)滌液(ye)，振蕩(dang)30秒，甩去洗滌液(ye)，用(yong)吸(xi)水(shui)紙拍幹。重(zhong)復此操作(zuo)3次(ci)。如果用(yong)洗(xi)板(ban)機(ji)洗(xi)滌，洗滌次數增加壹(yi)次(ci)。
每(mei)孔加入底(di)物(wu)A、B各50ul，輕(qing)輕振蕩(dang)混勻，37℃溫育(yu)0分鐘。避免(mian)光(guang)照。
取出酶標(biao)板(ban)，迅速加入50ul終(zhong)止(zhi)液(ye)，加入終(zhong)止(zhi)液(ye)後應(ying)立即(ji)測(ce)定(ding)結果。
在450nm波長處測(ce)定(ding)各孔的(de)OD值(zhi)。

試劑盒性能
. 靈敏度(du)：zui小(xiao)的(de)檢測(ce)濃(nong)度(du)小(xiao)於(yu)號(hao)標(biao)準(zhun)品(pin)。稀釋(shi)度(du)的(de)線性。樣(yang)品(pin)線性(xing)回歸(gui)與(yu)預(yu)期濃(nong)度(du)相(xiang)關系數R值(zhi)為(wei)0.990。
2. 特(te)異(yi)性：不與(yu)其(qi)它(ta)細胞因子反(fan)應(ying)。
3. 重復性：板(ban)內、板(ban)間變(bian)異(yi)系數均小(xiao)於(yu)0%。

結(jie) 果 判 斷(duan) 與(yu) 分 析(xi)
、儀器(qi)值(zhi)：於(yu)波(bo)長450nm的酶標(biao)儀上(shang)讀(du)取各(ge)孔的(de)OD值(zhi)

2、以吸光(guang)度(du)OD值(zhi)為(wei)縱坐(zuo)標（Y），相應(ying)的Endotoxins標(biao)準(zhun)品(pin)濃(nong)度(du)為(wei)橫坐(zuo)標（X），做(zuo)得(de)相(xiang)應(ying)的曲(qu)線，樣(yang)品(pin)的Endotoxins含(han)量可(ke)根據其(qi)OD值(zhi)由標準(zhun)曲線(xian)換(huan)算出相應(ying)的濃(nong)度(du)。

3、檢測(ce)值(zhi)範圍：0-80pg/ml

4、敏感(gan)度(du)： 0. pg/ml