豬甲狀腺素（T4）ELISA試(shi)劑盒(he)實驗(yan)原理(li)說明

　　試(shi)驗(yan)原(yuan)理(li)：
　　
　　豬(zhu)甲(jia)狀(zhuang)腺素T4試(shi)劑盒(he)是(shi)固相夾心(xin)法酶(mei)聯(lian)免(mian)疫吸附實(shi)驗(yan)（ELISA）.已(yi)知T4濃(nong)度的(de)標準(zhun)品(pin)、未知濃(nong)度的(de)樣(yang)品加(jia)入微(wei)孔酶標(biao)板(ban)內進行檢(jian)測(ce)。先將(jiang)T4和標(biao)記(ji)的(de)抗體同(tong)時溫育。洗滌後，加(jia)入親(qin)和素標記過的(de)HRP。再經過溫(wen)育和洗(xi)滌(di)，去除未結(jie)合的(de)酶結(jie)合物(wu)，然後(hou)加(jia)入底(di)物(wu)A、B，和酶(mei)結(jie)合物(wu)同(tong)時作(zuo)用。產(chan)生(sheng)顏色(se)。顏色(se)的(de)深淺和樣(yang)品中T4的(de)濃度呈(cheng)比(bi)例關系。
　　
　　操作(zuo)註(zhu)意事項(xiang)
　　
　　試(shi)劑應按標(biao)簽說明書(shu)儲存，使(shi)用前恢(hui)復到(dao)室溫。稀(xi)稀(xi)過後(hou)的(de)標準(zhun)品(pin)應丟(diu)棄(qi)，不(bu)可(ke)保(bao)存。
　　
　　實驗中不(bu)用(yong)的(de)板條應立即放(fang)回(hui)包(bao)裝袋中，密封(feng)保(bao)存，以免(mian)變(bian)質(zhi)。
　　
　　不(bu)用(yong)的(de)其(qi)它(ta)試(shi)劑應包(bao)裝好(hao)或(huo)蓋好(hao)。不(bu)同(tong)批號(hao)的(de)試(shi)劑不(bu)要(yao)混(hun)用。保(bao)質(zhi)前(qian)使(shi)用。
　　
　　使(shi)用壹次性的(de)吸頭以免(mian)交叉(cha)汙染(ran)，吸取終(zhong)止液(ye)和底(di)物(wu)A、B液(ye)時，避免(mian)使(shi)用帶金屬(shu)部分的(de)加(jia)樣(yang)器。
　　
　　使(shi)用幹凈(jing)的(de)塑(su)料容(rong)器配(pei)置(zhi)洗滌液(ye)。使(shi)用前充(chong)分混(hun)勻(yun)試(shi)劑盒(he)裏(li)的(de)各種成份及(ji)樣(yang)品。
　　
　　洗(xi)滌(di)酶(mei)標板時應充(chong)分拍(pai)幹，不(bu)要(yao)將(jiang)吸水紙(zhi)直(zhi)接(jie)放入酶(mei)標反應孔中吸水。
　　
　　底(di)物(wu)A應揮(hui)發(fa)，避(bi)免(mian)長時間打(da)開(kai)蓋子。底(di)物(wu)B對(dui)光敏(min)感，避(bi)免(mian)長時間暴(bao)露(lu)於(yu)光下。避(bi)免(mian)用手接觸(chu)，有毒。實驗(yan)完成(cheng)後應(ying)立(li)即(ji)讀(du)取OD值。
　　
　　加(jia)入試(shi)劑的(de)順序(xu)應壹(yi)致(zhi)，以保(bao)證(zheng)所(suo)有反應板(ban)孔溫育的(de)時間壹(yi)樣(yang)。
　　
　　按照(zhao)說明書(shu)中標明的(de)時間、加(jia)液(ye)的(de)量及(ji)順序(xu)進行溫(wen)育操作(zuo)。
　　
　　樣(yang)品收(shou)集(ji)、處(chu)理(li)及(ji)保(bao)存方(fang)法
　　
　　血(xue)清(qing)-----豬(zhu)甲(jia)狀腺素T4操作(zuo)過程(cheng)中避免(mian)任(ren)何(he)細(xi)胞刺(ci)激。使(shi)用不(bu)含(han)熱原和內毒素的(de)試(shi)管。收(shou)集(ji)血(xue)液(ye)後(hou)，000×g離心0分(fen)鐘(zhong)將(jiang)血(xue)清(qing)和紅細(xi)胞迅速小(xiao)心地(di)分離。
　　
　　血(xue)漿(jiang)-----EDTA、檸檬(meng)酸鹽、肝(gan)素血(xue)漿(jiang)可(ke)用(yong)於檢(jian)測(ce)。000×g離心30分(fen)鐘(zhong)去除顆粒(li)。
　　
　　細(xi)胞上(shang)清(qing)液(ye)---000×g離心0分(fen)鐘(zhong)去除顆粒(li)和聚(ju)合(he)物(wu)。
　　
　　組織(zhi)勻(yun)漿(jiang)-----將(jiang)組(zu)織(zhi)加(jia)入適(shi)量生理(li)鹽(yan)水(shui)搗(dao)碎。000×g離心0分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清(qing)液(ye)
　　
　　保(bao)存------如果樣(yang)品不(bu)立(li)即使(shi)用，應將(jiang)其(qi)分(fen)成小(xiao)部分(fen)-70℃保(bao)存，避免(mian)反復冷凍。盡(jin)可能(neng)的(de)不(bu)要(yao)使(shi)用溶血(xue)或(huo)高(gao)血(xue)脂(zhi)血(xue)。如(ru)果(guo)血(xue)清(qing)中大(da)量顆粒(li)，檢(jian)測(ce)前先(xian)離心或(huo)過濾(lv)。不(bu)要(yao)在(zai)37℃或(huo)更高(gao)的(de)溫度加(jia)熱(re)解(jie)凍(dong)。應(ying)在(zai)室溫下(xia)解(jie)凍(dong)並(bing)確保(bao)樣(yang)品均(jun)勻(yun)地(di)充(chong)分解(jie)凍(dong)。
　　
　　試(shi)劑的(de)準備(bei)
　　
　　標(biao)準品(pin)：標(biao)準(zhun)品的(de)系列(lie)稀(xi)釋(shi)應(ying)在(zai)實(shi)驗時準備(bei)，不(bu)能(neng)儲存。稀(xi)釋(shi)前(qian)將(jiang)標(biao)準(zhun)品(pin)振蕩混(hun)勻(yun)。稀(xi)釋(shi)比(bi)例按下(xia)表(biao)中進行：
　　
　　800nmol/L（6號(hao)標(biao)準品(pin)）原(yuan)倍濃度不(bu)用(yong)稀(xi)釋(shi)直(zhi)接(jie)加(jia)入50ul。
　　
　　400nmol/L（5號(hao)標(biao)準品(pin)）00ul的(de)原倍標準(zhun)品加(jia)入00ul的(de)標準(zhun)品(pin)稀(xi)釋(shi)液(ye)
　　
　　200nmol/L（4號(hao)標(biao)準品(pin)）00ul的(de)5號(hao)標(biao)準品(pin)加(jia)入00ul的(de)標準(zhun)品(pin)稀(xi)釋(shi)液(ye)
　　
　　00nmol/L（3號(hao)標(biao)準品(pin)）00ul的(de)4號(hao)標(biao)準品(pin)加(jia)入00ul的(de)標準(zhun)品(pin)稀(xi)釋(shi)液(ye)
　　
　　50nmol/L（2號(hao)標(biao)準品(pin)）00ul的(de)3號(hao)標(biao)準品(pin)加(jia)入00ul的(de)標準(zhun)品(pin)稀(xi)釋(shi)液(ye)
　　
　　25nmol/L（號(hao)標(biao)準品(pin)）00ul的(de)2號(hao)標(biao)準品(pin)加(jia)入00ul的(de)標準(zhun)品(pin)稀(xi)釋(shi)液(ye)
　　
　　0nmol/L（空白(bai)對(dui)照）原(yuan)始濃(nong)度不(bu)用(yong)稀(xi)釋(shi)直(zhi)接(jie)加(jia)入50ul。
　　
　　洗(xi)滌緩(huan)沖(chong)液(ye)（50×）的(de)稀(xi)釋(shi)：蒸餾水(shui)50倍稀(xi)釋(shi)。
　　
　　操作(zuo)步驟(zhou)
　　
　　豬(zhu)甲狀(zhuang)腺素T4使(shi)用前，將(jiang)所(suo)有(you)試(shi)劑充(chong)分混(hun)勻(yun)。不(bu)要(yao)使(shi)液(ye)體產(chan)生(sheng)大(da)量的(de)泡沫(mo)，以免(mian)加(jia)樣(yang)時加(jia)入大(da)量的(de)氣(qi)泡(pao)，產(chan)生(sheng)加(jia)樣(yang)上(shang)的(de)誤差(cha)。
　　
　　根(gen)據(ju)待(dai)測(ce)樣(yang)品數量加(jia)上(shang)標(biao)準品(pin)的(de)數量決(jue)定(ding)所需的(de)板條數。每(mei)個(ge)標準品和空白(bai)孔建議做復孔。每(mei)個(ge)樣(yang)品根(gen)據(ju)自己(ji)的(de)數量來(lai)定，能(neng)使(shi)用復孔的(de)盡(jin)量做復孔。標本(ben)用(yong)標(biao)本(ben)稀(xi)釋(shi)液(ye)：稀(xi)釋(shi)後(hou)加(jia)入50ul於(yu)反應孔內。
　　
　　加(jia)入稀(xi)釋(shi)好(hao)後(hou)的(de)標準(zhun)品(pin)50ul於反(fan)應(ying)孔、加(jia)入待(dai)測(ce)樣(yang)品50ul於(yu)反(fan)應(ying)孔內。立(li)即(ji)加(jia)入50ul的(de)標記(ji)的(de)抗體。蓋(gai)上(shang)膜(mo)板，輕(qing)輕(qing)振蕩混(hun)勻(yun)，37℃溫(wen)育小(xiao)時。
　　
　　甩去孔內液(ye)體，每(mei)孔加(jia)滿(man)洗(xi)滌(di)液(ye)，振蕩30秒(miao)，甩去洗滌(di)液(ye)，用(yong)吸水紙(zhi)拍(pai)幹(gan)。重復此操作(zuo)3次。如(ru)果用(yong)洗板機洗(xi)滌(di)，洗滌(di)次(ci)數增加(jia)壹(yi)次(ci)。
　　
　　每(mei)孔加(jia)入60ul的(de)親和鏈(lian)酶(mei)素-HRP，輕(qing)輕(qing)振蕩混(hun)勻(yun)，37℃溫(wen)育30分鐘(zhong)。
　　
　　甩(shuai)去孔內液(ye)體，每(mei)孔加(jia)滿(man)洗(xi)滌(di)液(ye)，振蕩30秒(miao)，甩去洗滌(di)液(ye)，用(yong)吸水紙(zhi)拍(pai)幹(gan)。重復此操作(zuo)3次。如(ru)果用(yong)洗板機洗(xi)滌(di)，洗滌(di)次(ci)數增加(jia)壹(yi)次(ci)。
　　
　　每(mei)孔加(jia)入底(di)物(wu)A、B各50ul，輕(qing)輕(qing)振蕩混(hun)勻(yun)，37℃溫(wen)育0分鐘(zhong)。避(bi)免(mian)光照。
　　
　　取出(chu)酶(mei)標板，迅速加(jia)入50ul終(zhong)止液(ye)，加(jia)入終(zhong)止液(ye)後(hou)應(ying)立(li)即(ji)測(ce)定結(jie)果。
　　
　　在450nm波(bo)長(chang)處測(ce)定各孔的(de)OD值。
　　
　　局限(xian)
　　
　　6號(hao)標(biao)準品(pin)以上(shang)的(de)結(jie)果為(wei)非線(xian)性的(de)，根(gen)據(ju)此標(biao)準曲(qu)線(xian)無法得(de)到(dao)的(de)結(jie)果。
　　
　　豬甲(jia)狀(zhuang)腺素T4試(shi)劑盒(he)性能(neng)
　　
　　.靈(ling)敏(min)度：zui小(xiao)的(de)檢(jian)測(ce)濃度小(xiao)於號(hao)標(biao)準品(pin)。稀(xi)釋(shi)度的(de)線(xian)性。樣(yang)品線(xian)性回(hui)歸(gui)與(yu)預(yu)期(qi)濃(nong)度相關系(xi)數R值為(wei)0.990。
　　
　　2.特(te)異性：不(bu)與(yu)其(qi)它(ta)細(xi)胞因子反(fan)應(ying)。
　　
　　3.重復性：板(ban)內、板(ban)間(jian)變(bian)異(yi)系(xi)數均(jun)小(xiao)於0%。
　　
　　結(jie)果判斷(duan)與(yu)分(fen)析
　　
　　、儀器值：於波(bo)長(chang)450nm的(de)酶標(biao)儀上(shang)讀(du)取各孔的(de)OD值
　　
　　2、以吸光度OD值為(wei)縱(zong)坐(zuo)標(biao)（Y），相應的(de)T4標準(zhun)品(pin)濃度為(wei)橫坐標（X），做得(de)相應的(de)曲(qu)線(xian)，樣(yang)品的(de)T4含量可根(gen)據(ju)其(qi)OD值由(you)標(biao)準曲(qu)線(xian)換(huan)算(suan)出(chu)相應的(de)濃度。
　　
　　3、檢(jian)測(ce)值範圍(wei)：0-800nmol/L
　　
　　4、敏(min)感度：.0nmol/L