單(dan)克(ke)隆(long)抗體制備過(guo)程

、免(mian)疫動物

免(mian)疫動物是(shi)用目(mu)的(de)抗(kang)原免(mian)疫小鼠(shu)，使(shi)小鼠(shu)產(chan)生致(zhi)敏B淋巴(ba)細(xi)胞的(de) 過(guo)程。 壹般(ban)選(xuan)用(yong)6-8周齡雌(ci)性BALB/c小鼠(shu)，按(an)照預先制定(ding)的(de)免(mian)疫方(fang)案(an)進行免(mian)疫註(zhu)射。 抗原通過(guo)血(xue)液(ye)循環或(huo)淋巴(ba)循環進入(ru)外周免疫器官(guan)，刺激相(xiang)應(ying)B淋巴(ba)細(xi)胞克(ke)隆(long)，使其(qi)活化(hua)、增(zeng)殖，並分化(hua)成(cheng)為致(zhi)敏B淋巴(ba)細(xi)胞。

2、細(xi)胞融(rong)合

采(cai)用(yong)二氧(yang)化(hua)碳(tan)氣(qi)體(ti)處死小鼠(shu)，無(wu)菌操(cao)作取出脾(pi)臟，在(zai)平皿內(nei)擠壓研磨，制備脾(pi)細(xi)胞懸液(ye)。 將準備(bei)好的(de)同(tong)系骨髓瘤細(xi)胞與小鼠(shu)脾(pi)細(xi)胞按(an)壹定(ding)比例(li)混(hun)合(he)，並加(jia)入(ru)促(cu)融(rong)合劑聚乙(yi)二(er)醇(chun)。在聚乙(yi)二(er)醇(chun)作用(yong)下(xia)，各(ge)種(zhong)淋巴(ba)細(xi)胞可(ke)與骨(gu)髓瘤細(xi)胞發(fa)生融(rong)合，形(xing)成(cheng)雜(za)交(jiao)瘤細(xi)胞。

3、選(xuan)擇性培(pei)養

選(xuan)擇性培(pei)養的(de)目(mu)的(de)是(shi)篩(shai)選(xuan)融(rong)合的(de)雜(za)交(jiao)瘤細(xi)胞，壹般(ban)采用(yong)HAT選(xuan)擇性培(pei)養基。在HAT培(pei)養基中(zhong)，未(wei)融(rong)合的(de)骨(gu)髓瘤細(xi)胞因缺乏(fa)次黃嘌(piao)呤--磷(lin)酸(suan)核(he)糖(tang)轉(zhuan)移(yi)酶，不能利(li)用(yong)補(bu)救(jiu)途徑(jing)合(he)成(cheng)DNA而(er)死亡(wang)。 未(wei)融(rong)合的(de)淋巴(ba)細(xi)胞雖(sui)具有(you)次(ci)黃嘌(piao)呤--磷(lin)酸(suan)核(he)糖(tang)轉(zhuan)移(yi)酶，但(dan)其(qi)本身(shen)不(bu)能(neng)在(zai)體外存(cun)活也(ye)逐漸死(si)亡(wang)。 只有(you)融(rong)合的(de)雜(za)交(jiao)瘤細(xi)胞由於從(cong)脾細(xi)胞獲(huo)得了次黃嘌(piao)呤--磷(lin)酸(suan)核(he)糖(tang)轉(zhuan)移(yi)酶，並具有(you)骨(gu)髓瘤細(xi)胞能(neng)無限(xian)增(zeng)殖的(de)特性，因此能(neng)在HAT培(pei)養基中(zhong)存(cun)活和增(zeng)殖。

4、雜交(jiao)瘤陽(yang)性克(ke)隆(long)的(de)篩(shai)選(xuan)與克(ke)隆(long)化(hua)

在(zai)HAT培養基中(zhong)生長的(de)雜(za)交(jiao)瘤細(xi)胞，只(zhi)有少(shao)數是(shi)分(fen)泌預定(ding)特異(yi)性(xing)單(dan)克(ke)隆(long)抗體的(de)細(xi)胞，因此，必(bi)須進行篩(shai)選(xuan)和(he)克(ke)隆(long)化(hua)。通常(chang)采(cai)用(yong)有(you)限(xian)稀(xi)釋(shi)法進行雜(za)交(jiao)瘤細(xi)胞的(de)克(ke)隆(long)化(hua)培(pei)養。采用(yong)靈敏、快(kuai)速(su)、特異(yi)的(de)免(mian)疫學方(fang)法，篩(shai)選(xuan)出能(neng)產生所需(xu)單(dan)克(ke)隆(long)抗體的(de)陽(yang)性(xing)雜(za)交(jiao)瘤細(xi)胞，並進行克(ke)隆(long)擴(kuo)增(zeng)。經過(guo)全面(mian)鑒(jian)定(ding)其(qi)所分(fen)泌(mi)單(dan)克(ke)隆(long)抗體的(de)免(mian)疫球蛋(dan)白(bai)類型、亞類、特異(yi)性(xing)、親(qin)和(he)力(li)、識別(bie)抗原的(de)表(biao)位(wei)及其(qi)分子(zi)量後(hou)，及時進行凍(dong)存(cun)。

5、單(dan)克(ke)隆(long)抗體的(de)大(da)量制備

單(dan)克(ke)隆(long)抗體的(de)大(da)量制備主(zhu)要采(cai)用動物體(ti)內(nei)誘生法和(he)體外培(pei)養法。
()體(ti)內(nei)誘生法 取(qu)BALB/c小鼠(shu)，首(shou)先(xian)腹腔(qiang)註(zhu)射0.5ml液(ye)體(ti)石蠟或降(jiang)植烷(wan)進行預處理(li)。-2周後，腹(fu)腔(qiang)內(nei)接(jie)種(zhong)雜交(jiao)瘤細(xi)胞。雜(za)交(jiao)瘤細(xi)胞在(zai)小鼠(shu)腹(fu)腔(qiang)內(nei)增(zeng)殖，並產生和分(fen)泌單(dan)克(ke)隆(long)抗體。約-2周，可(ke)見小鼠(shu)腹(fu)部(bu)膨大。用註(zhu)射器抽(chou)取腹(fu)水(shui)，即可(ke)獲(huo)得大量單(dan)克(ke)隆(long)抗體。
(2)體外培(pei)養法 將雜交(jiao)瘤細(xi)胞置(zhi)於培養瓶中(zhong)進行培(pei)養。在培(pei)養過(guo)程中(zhong)，雜(za)交(jiao)瘤細(xi)胞產(chan)生並分泌(mi)單(dan)克(ke)隆(long)抗體，收集(ji)培(pei)養上清(qing)液(ye)，離(li)心(xin)去除細(xi)胞及其(qi)碎片，即可(ke)獲(huo)得所需(xu)要的(de)單(dan)克(ke)隆(long)抗體。但(dan)這種(zhong)方(fang)法產(chan)生的(de)抗(kang)體(ti)量有(you)限(xian)。各(ge)種(zhong)新型培(pei)養技術(shu)和(he)裝置不斷(duan)出現(xian)，大大(da)提(ti)高了抗體的(de)量。

抗(kang)原準(zhun)備

編輯(ji)
抗原，是(shi)指能夠(gou)刺激機體(ti)產(chan)生（特異(yi)性(xing)）免疫應答，並能與免(mian)疫應答產物抗(kang)體和(he)致(zhi)敏淋巴(ba)細(xi)胞在(zai)體外結(jie)合，發(fa)生免疫效(xiao)應（特異(yi)性(xing)反應）的(de)物質(zhi)。抗原的(de)基本特性有兩種(zhong)，壹是誘導免疫應答的(de)能(neng)力(li)，也(ye)就是免疫原性(xing)，二是(shi)與免(mian)疫應答的(de)產(chan)物發(fa)生反應(ying)，也(ye)就是抗原性(xing)。
很多(duo)物質(zhi)都可(ke)以(yi)成(cheng)為抗原，抗(kang)原的(de)具體(ti)分(fen)類可(ke)以(yi)參(can)見抗(kang)原，在(zai)進行單(dan)克(ke)隆(long)抗體制備過(guo)程中(zhong)，很多(duo)物質(zhi)都可(ke)以(yi)成(cheng)為抗原，在(zai)常(chang)規(gui)的(de)科(ke)研實(shi)驗中(zhong)，科(ke)研者(zhe)經常(chang)選(xuan)用(yong)每(mei)只小鼠(shu)/大(da)鼠每(mei)次註(zhu)射0~50ug重組(zu)蛋(dan)白(bai)、偶聯(lian)多(duo)肽(tai)、偶聯(lian)小分(fen)子(zi)等(deng)作(zuo)為抗原產(chan)生特異(yi)性(xing)的(de)單(dan)克(ke)隆(long)抗體。

動物免(mian)疫

編輯(ji)
單(dan)克(ke)隆(long)抗體制備的(de)宿(xiu)主(zhu)動物壹般(ban)選(xuan)用(yong)BALB/c小鼠(shu)，鼠(shu)單(dan)抗(kang)的(de)應(ying)用(yong)範(fan)圍(wei)相(xiang)當(dang)廣泛，壹些國內(nei)外公司均(jun)開發(fa)出了(le)兔(tu)的(de)單(dan)克(ke)隆(long)抗體制備技(ji)術(shu)。
免(mian)疫原分(fen)為可(ke)溶(rong)性(xing)抗原和(he)顆粒(li)性（細(xi)胞）抗(kang)原，用(yong)無菌(jun)鹽水(shui)稀釋(shi)並與佐(zuo)劑混(hun)合(he)，腹腔(qiang)註(zhu)射抗原與佐(zuo)劑*混(hun)勻後(hou)形(xing)成(cheng)的(de)穩(wen)定(ding)乳(ru)狀液(ye)，在(zai)免(mian)疫原提(ti)供(gong)持(chi)續(xu)的(de)免(mian)疫應答基礎(chu)上進行加(jia)強免(mian)疫
周期(qi)第(di)天(tian) 采血(xue)0.2ml（獲(huo)得0.ml免疫前(qian)血(xue)清(qing)）
*次免疫（抗原加(jia)弗氏*佐(zuo)劑）
第(di)4天(tian) 第(di)二(er)次免(mian)疫（抗原加(jia)弗氏不*佐(zuo)劑）
第(di)2天(tian) 采血(xue)和(he)ELISA檢測
第(di)35天(tian) 第(di)三(san)次免(mian)疫（抗原加(jia)弗氏不*佐(zuo)劑）
第(di)42天(tian) 采血(xue)和(he)ELISA檢測
第(di)56天(tian) 第(di)四(si)次(ci)免疫（抗原溶(rong)於PBS或鹽水(shui)）
第(di)6天(tian) 細(xi)胞融(rong)合

細(xi)胞融(rong)合

編輯(ji)

（壹）融(rong)合劑

細(xi)胞融(rong)合的(de)方(fang)法有(you)物理(li)法，如(ru)電融(rong)合、激光融(rong)合，化(hua)學融(rong)合法和(he)生物融(rong)合法，如(ru)滅活的(de)仙(xian)臺病(bing)毒(du)，此(ci)處例舉(ju)化(hua)學融(rong)合法中(zhong)的(de)壹種(zhong)即聚乙(yi)二(er)醇(chun)融(rong)合法。聚乙(yi)二(er)醇(chun)（PEG），在分(fen)子(zi)量為200～700時，呈無色(se)、無(wu)臭的(de)粘(zhan)稠狀液(ye)體(ti)，分(fen)子(zi)量大(da)於000時，呈乳(ru)白(bai)色(se)蠟(la)狀固體，能(neng)溶(rong)於水(shui)、乙醇(chun)及其(qi)他(ta)許(xu)多有(you)機溶(rong)劑，對(dui)熱穩定(ding)，與許(xu)多化(hua)學藥品(pin)不(bu)起作(zuo)用。用(yong)作細(xi)胞融(rong)合劑的(de)聚乙(yi)二(er)醇(chun)壹般(ban)選(xuan)用(yong)分(fen)子(zi)量為4000者，常(chang)用(yong)濃(nong)度(du)為50%，pH8.0～pH8.2（用0%NaHCO3調(tiao)整(zheng)），分子(zi)量小的(de)PEG，融(rong)合效(xiao)應差(cha)，又(you)有(you)毒(du)性，分子量過(guo)大，則粘(zhan)性太大(da)，不易操作。50%濃(nong)度(du)，pH偏堿時融(rong)合效(xiao)應zui高。也(ye)有采(cai)用30%～50%濃(nong)度(du)的(de)PEG加(jia)上0%二(er)甲亞碸(feng)。不同(tong)批(pi)號的(de)PEG，即使(shi)分(fen)子量相(xiang)同(tong)，但(dan)融(rong)合率(lv)卻有(you)明顯(xian)差(cha)異(yi)，選(xuan)用(yong)時必(bi)須註(zhu)意。每(mei)批(pi)都必(bi)須進行細(xi)胞毒(du)性試驗(yan)後方(fang)可(ke)應用(yong)。要買(mai)高純度(du)的(de)，壹般(ban)選(xuan)供(gong)氣(qi)相(xiang)色(se)譜用的(de)PEG。