進口(kou)ELISA試劑盒(he)操作如(ru)何(he)讓ELISA系(xi)統(tong)更穩(wen)定

進(jin)口(kou)ELISA試劑盒(he)檢(jian)測(ce)系(xi)統(tong)可謂(wei)是(shi)免疫學(xue)反應應(ying)用到科研(yan)中(zhong)zui為靈(ling)敏的技(ji)術手(shou)段(duan)。可是(shi)在新(xin)老(lao)手(shou)操作過(guo)程(cheng)中(zhong)總是(shi)會出(chu)現或(huo)大(da)或(huo)小(xiao)的問(wen)題(ti)，本(ben)人在剛(gang)開(kai)始(shi)做ELISA時就面臨(lin)很多(duo)困難，雖然(ran)有師(shi)兄(xiong)師(shi)姐(jie)鋪路(lu)，但還(hai)是(shi)常常(chang)做得壹塌(ta)糊(hu)塗(tu)，比(bi)如說(shuo)花(hua)板(ban)，假(jia)陽性，全(quan)顯色，全(quan)部(bu)顯色，顯色比(bi)空(kong)白還(hai)低,自(zi)己(ji)也(ye)為此苦(ku)惱過很長(chang)壹段時間，隨(sui)著自(zi)己(ji)技(ji)術水(shui)平(ping)得提高(gao)，或(huo)多(duo)或少地也(ye)掌(zhang)握(wo)了(le)ELISA體系的(de)脾氣，也(ye)是(shi)熟能生巧吧(ba)，現在做方陣，做ELISA已是(shi)輕車(che)熟路(lu)了(le)，以(yi)前檢(jian)測(ce)壹種抗體用整(zheng)整壹下午還(hai)算得暈暈(yun)的(de)，現在給我(wo)十(shi)個(ge)八(ba)個(ge)的從(cong)包被到顯色，壹個(ge)工作(zuo)日基本搞(gao)定。下(xia)面就由我拋(pao)磚(zhuan)引玉地(di)來(lai)說(shuo)壹下，做ELISA的經(jing)驗(yan)總結:
 、包(bao)被原(yuan)的性(xing)質(zhi)很重(zhong)要，蛋(dan)白濃(nong)度，是(shi)否(fou)降(jiang)解，這(zhe)關(guan)系到妳(ni)做出(chu)的(de)抗體可不可以(yi)被其(qi)識(shi)別(bie)，所(suo)以(yi)保存(cun)抗原(yuan)很重(zhong)要，我(wo)做重組蛋(dan)白時，師(shi)兄(xiong)都(dou)嚴(yan)格警告我(wo)壹定要在冰(bing)浴(yu)下緩慢(man)融(rong)化(hua)就(jiu)是(shi)這(zhe)個(ge)道理(li)。還(hai)有有(you)的(de)包(bao)被原(yuan)可能不是(shi)蛋白，對(dui)於和(he)脂(zhi)類(lei)物(wu)質(zhi)或(huo)小(xiao)分子物質(zhi)我(wo)們(men)要事先(xian)對(dui)其(qi)改(gai)造再加(jia)以(yi)包被，我把方(fang)法簡要(yao)的(de)列出(chu)如(ru)下:①親和素(su):先親(qin)和素(su)先包(bao)被載體，加(jia)入(ru)化(hua)的(de)DNA，這(zhe)種(zhong)包(bao)被方法均勻、牢(lao)固(gu)，已(yi)擴(kuo)大(da)應(ying)用於(yu)各種抗原(yuan)物質(zhi)的(de)定(ding)量測(ce)定(ding)。②脂(zhi)類(lei)物(wu)質(zhi):可將其(qi)在有(you)機(ji)溶(rong)劑(例如(ru)乙(yi)醇)中(zhong)溶(rong)解後加(jia)入(ru)ELISA板(ban)孔(kong)中(zhong)，開(kai)蓋(gai)置(zhi)冰箱guo ye或冷(leng)風吹幹，待酒精揮發(fa)後(hou)，讓脂(zhi)質自(zi)然(ran)幹固(gu)在固(gu)相(xiang)表(biao)面。③小(xiao)分子必(bi)須依(yi)靠和大(da)的蛋(dan)白載體偶聯(lian)後(hou)才(cai)能(neng)固(gu)定(ding)在固(gu)相(xiang)載體上。
 2、進(jin)口(kou)ELISA試劑盒(he)包被液的(de)選擇(ze)，壹般選擇(ze)ph9.6的(de)碳(tan)酸鹽(yan)緩沖(chong)液(ye)。但(dan)有(you)時由於試驗(yan)的需要(yao)，包(bao)被原(yuan)的特殊性(xing)也(ye)可能采(cai)用中(zhong)性(xing)的(de)緩沖(chong)溶(rong)液(ye)來(lai)包(bao)。應註意以(yi)下原(yuan)理(li)：由於蛋(dan)白質與聚(ju)苯乙(yi)烯(xi)固(gu)相(xiang)載體是(shi)通過(guo)物理(li)吸附(fu)結合(he)的(de)，靠的是(shi)蛋白質分子結構(gou)上的(de)疏水(shui)基團(tuan)與(yu)固(gu)相(xiang)載體表(biao)面的(de)疏水(shui)基團(tuan)間(jian)的作用，這(zhe)種(zhong)物(wu)理(li)吸附(fu)是(shi)非特異性(xing)的(de)，受蛋白質的分(fen)子量、等(deng)電(dian)點、濃(nong)度等(deng)的(de)影響(xiang)，大分(fen)子蛋白質較小(xiao)分子蛋白質通常(chang)含有(you)更(geng)多(duo)的疏(shu)水(shui)基團(tuan)，故(gu)更(geng)易吸附(fu)到固(gu)相(xiang)載體表(biao)面。具(ju)體的試驗(yan)還(hai)要有(you)堅(jian)固(gu)的(de)理(li)論外(wai)也(ye)要實踐(jian)，看(kan)壹下zui終可不可以(yi)應用到自己試驗(yan)當中(zhong)去。常(chang)用(yong)的包(bao)被液除(chu)了(le)剛(gang)才(cai)提(ti)到的pH9.6碳酸(suan)鹽(yan)緩沖(chong)液(ye)，還(hai)有pH7.2的(de)磷酸(suan)鹽(yan)緩沖(chong)液(ye)和(he)pH7-8的(de)Tris-HCL緩沖(chong)液(ye)等(deng)等(deng)。
 3、封(feng)閉：繼(ji)包被之後(hou)用高濃(nong)度的(de)無(wu)關(guan)蛋白質溶(rong)液(ye)再包被的過(guo)程。封(feng)閉(bi)就(jiu)是(shi)讓大(da)量(liang)不相關(guan)的蛋(dan)白質充填這(zhe)些(xie)空(kong)隙(xi)，從而(er)排斥ELISA後的步(bu)驟中(zhong)幹擾物(wu)質的(de)再吸附(fu)。常(chang)用封閉(bi)劑有：0.05%-0.5%的BSA;0%的小(xiao)牛(niu)血(xue)清或(huo)%明(ming)膠;脫脂(zhi)奶粉(fen)，比(bi)較(jiao)價廉(lian)，可以(yi)高濃(nong)度使(shi)用(yong)(5%-0%);還(hai)有壹些(xie)稀(xi)有用(yong)到的各種動(dong)物血清(主(zhu)要(yao)為了(le)排除(chu)相(xiang)似蛋(dan)白幹擾)和(he)酪蛋(dan)白等(deng)等(deng)。但(dan)zui終選用(yong)什麽，要(yao)依(yi)據(ju)試驗(yan)具體來(lai)實(shi)踐(jian)。
 4、洗滌(di)板(ban)：可以(yi)說在ELISA操作中(zhong)，洗滌(di)是(shi)zui主要(yao)的(de)關(guan)鍵技(ji)術。因(yin)為聚(ju)苯乙(yi)烯(xi)等(deng)塑(su)料(liao)對(dui)蛋白質的吸附(fu)是(shi)普(pu)遍(bian)性的(de)，為達到分離遊(you)離(li)的(de)和結合(he)的(de)酶(mei)標記(ji)物(wu)的目(mu)的(de)，清除(chu)殘(can)留(liu)在板(ban)孔(kong)中(zhong)遊(you)離(li)的(de)物質，以(yi)及非特異性(xing)地(di)吸附(fu)的(de)幹擾物(wu)質，在洗滌(di)時又應把這(zhe)種(zhong)非(fei)特異性(xing)吸附(fu)的(de)幹擾物(wu)質洗滌(di)下(xia)來(lai)。所(suo)以(yi)在洗板(ban)時會有壹定誤(wu)差，人為因素(su)很大(da)(當然(ran)有條(tiao)件(jian)的用洗板(ban)機除(chu)外(wai))，洗的不*或串了(le)孔(kong)，對(dui)如此(ci)靈(ling)敏的ELISA系(xi)統可是(shi)不小(xiao)的影響(xiang)。
 5、加(jia)抗(kang)體標本(ben)(和二(er)抗(kang)):註(zhu)意(yi)該換槍頭時換槍頭。標本(ben)稀(xi)釋壹般可用pbs稀(xi)釋，也(ye)可用封(feng)閉液(ye)去稀(xi)釋。如(ru)需加(jia)二(er)抗(kang)，還(hai)要註(zhu)意(yi)二(er)抗的工(gong)作濃(nong)度，太(tai)高(gao)浪費，太(tai)低(di)則(ze)著(zhe)色淺(qian)。
 6、顯色:顯色系(xi)統(tong)又很多(duo)，我們(men)壹開始做的時候(hou)，要(yao)選(xuan)擇(ze)適(shi)宜的顯色系(xi)統(tong)。註意(yi)顯色系(xi)統(tong)酶(mei)活(huo)性(xing)底(di)物(wu)的保存(cun)HRP結合(he)物(wu)加(jia)硫(liu)柳(liu)泵，AP結合(he)物(wu)可加(jia)疊(die)氮(dan)鈉(na)。
 7、進口(kou)ELISA試劑盒(he)每次(ci)做盡量(liang)要(yao)把陰(yin)陽(yang)空(kong)三個(ge)對(dui)照(zhao)做好(hao)，如(ru)出(chu)現問(wen)題(ti)也(ye)好(hao)分(fen)析(xi)。