國產(chan)ELISA試劑(ji)盒如(ru)何正(zheng)確(que)的(de)進行ELISA操作(zuo)實(shi)驗

國產(chan)ELISA試劑(ji)盒通常為(wei)采(cai)用手(shou)工操(cao)作(zuo)的(de)以(yi)微孔板條為(wei)固(gu)相(xiang)的(de)測(ce)定模(mo)式，測(ce)定操作(zuo)非(fei)常(chang)簡(jian)單(dan)，壹(yi)般涉及(ji)到(dao)標(biao)本(ben)的(de)收集(ji)保存(cun)、試劑(ji)準備(bei)、加(jia)樣(yang)、溫育(yu)、洗板(ban)、顯(xian)色、比(bi)色(se)、結(jie)果判(pan)斷(duan)和(he)結(jie)果報(bao)告(gao)及解釋等方面(mian)，其中任壹(yi)步(bu)驟(zhou)的(de)不(bu)當都會影(ying)響測(ce)定結(jie)果，且(qie)尤以(yi)加(jia)樣(yang)、溫育(yu)和(he)洗板(ban)等(deng)步(bu)驟(zhou)為(wei)甚(shen)。現(xian)分(fen)述(shu)如下。
壹(yi)、臨(lin)床標(biao)本(ben)的(de)收集(ji)和(he)保存(cun)
用(yong)於ELISA測(ce)定的(de)臨(lin)床標(biao)本(ben)zui為(wei)常(chang)用的(de)是(shi)血(xue)清（漿），有時(shi)因(yin)為(wei)特(te)定的(de)檢測(ce)目(mu)的(de)，也用(yong)到(dao)唾(tuo)液、腦(nao)脊(ji)液、尿液、糞便(bian)等(deng)標本。目(mu)前(qian)臨(lin)床上(shang)使用血清標本(ben)測(ce)定的(de)標誌(zhi)物壹(yi)般有傳(chuan)染(ran)性(xing)病(bing)原體的(de)抗原和(he)抗(kang)體、腫瘤(liu)標誌物、激(ji)素、特(te)種蛋(dan)白、細胞(bao)因(yin)子(zi)和(he)治(zhi)療(liao)藥物等(deng)。對(dui)用於激(ji)素和(he)治(zhi)療(liao)藥物測(ce)定的(de)血清(qing)標本(ben)的(de)收集(ji)，要註(zhu)意(yi)收(shou)集時(shi)間(jian)甚(shen)或體位有可(ke)能(neng)會(hui)對(dui)測(ce)定結(jie)果產(chan)生影(ying)響。如可(ke)的(de)松在(zai)早晨4～6點之間(jian)，會(hui)有壹(yi)峰值出現(xian)：生(sheng)長激(ji)素、促黃體激(ji)素（LH）和(he)促卵(luan)泡(pao)激(ji)素（FSH）均(jun)以(yi)陣發(fa)性(xing)方(fang)式釋放，因(yin)此(ci)，在(zai)測(ce)定此(ci)類激(ji)素時(shi)，有必(bi)要在(zai)密(mi)切相(xiang)連的(de)時間(jian)間(jian)隔(ge)內(nei)采(cai)取(qu)數份血樣(yang)本(ben)，以(yi)其中間(jian)值為(wei)測(ce)定值。又如(ru)當(dang)從臥位變為(wei)站(zhan)立位時，血(xue)清(qing)中腎素(su)活性(xing)將(jiang)出現(xian)明顯(xian)增(zeng)高。再(zai)如治(zhi)療(liao)藥物的(de)檢測(ce)，應(ying)根(gen)據(ju)藥代(dai)動(dong)力(li)學選(xuan)擇(ze)服(fu)藥(yao)後的(de)zui適時(shi)間(jian)抽血檢測(ce)。用(yong)於傳(chuan)染(ran)性(xing)病(bing)原體的(de)抗原和(he)抗(kang)體、腫瘤(liu)標誌物和(he)特(te)種蛋(dan)白等(deng)的(de)檢測(ce)的(de)血清(qing)標本(ben)的(de)收集(ji)則沒有時(shi)間(jian)和(he)體位方面(mian)的(de)影(ying)響，只(zhi)是(shi)在(zai)處(chu)理和(he)保存(cun)方(fang)面(mian)要(yao)考慮(lv)以(yi)下幾個(ge)方(fang)面(mian)：
（）要(yao)註意(yi)避(bi)免出現(xian)嚴重溶(rong)血。血(xue)紅(hong)蛋(dan)白中含有血(xue)紅(hong)素(su)基團，其有類似(si)過氧(yang)化物的(de)活性(xing)，因(yin)此(ci)，在(zai)以(yi)HRP為(wei)標(biao)記(ji)酶(mei)的(de)ELISA測(ce)定中，如血(xue)清標(biao)本中血紅(hong)蛋(dan)白濃度較(jiao)高，則其就很(hen)容(rong)易在(zai)溫育(yu)過(guo)程中吸附(fu)於固(gu)相(xiang)，從而與(yu)後面(mian)加(jia)入(ru)的(de)HRP底物反(fan)應顯(xian)色。
（2）樣(yang)本(ben)的(de)采(cai)集及血(xue)清分(fen)離(li)中要註(zhu)意(yi)盡(jin)量避(bi)免細菌(jun)汙染，壹(yi)則細菌(jun)的(de)生長(chang)，其所(suo)分(fen)泌(mi)的(de)壹些酶(mei)可(ke)能(neng)會(hui)對(dui)抗原抗體等蛋白產(chan)生分(fen)解作(zuo)用(yong)；二則壹些細菌(jun)的(de)內(nei)源性(xing)酶(mei)如(ru)大(da)腸(chang)桿菌(jun)的(de)β-半乳(ru)糖苷酶(mei)本(ben)身(shen)會(hui)對(dui)用相(xiang)應(ying)酶(mei)作(zuo)標(biao)記(ji)的(de)測(ce)定方法(fa)產(chan)生非(fei)特(te)異(yi)性(xing)幹擾。
（3）血清(qing)標(biao)本(ben)如是(shi)以(yi)無菌(jun)操作分(fen)離(li)，則可以(yi)在(zai)2～8℃下保存(cun)壹(yi)周(zhou)，如(ru)為(wei)有菌(jun)操作，則建議冰凍(dong)保存(cun)。樣(yang)本(ben)的(de)長時(shi)間(jian)保存(cun)，應(ying)在(zai)-70℃以(yi)下。
（4）冰凍(dong)保存(cun)的(de)血清(qing)標本(ben)須註意(yi)避(bi)免因(yin)停(ting)電(dian)等造成的(de)反復(fu)凍(dong)融。標(biao)本的(de)反復(fu)凍(dong)融所(suo)產(chan)生的(de)機械(xie)剪(jian)切力(li)將對(dui)標本(ben)中的(de)蛋白(bai)等分(fen)子產(chan)生破(po)壞作(zuo)用，從而引起(qi)假陰(yin)性(xing)結(jie)果。此(ci)外(wai)，凍(dong)融標(biao)本的(de)混勻(yun)亦(yi)應(ying)註(zhu)意(yi)，不(bu)要進行劇烈(lie)振蕩(dang)，反復(fu)顛倒混勻(yun)即可(ke)。
（5）標本(ben)在(zai)保存(cun)中如出(chu)現(xian)細菌(jun)汙染所(suo)致(zhi)的(de)混濁(zhuo)或絮(xu)狀(zhuang)物時(shi)，應離(li)心沈(chen)澱(dian)後取(qu)上(shang)清(qing)檢測(ce)。
二、國產(chan)ELISA試劑(ji)盒試劑(ji)準備(bei)
在(zai)臨(lin)床實(shi)驗(yan)室，對(dui)試劑(ji)準備(bei)壹般(ban)不(bu)太(tai)註意(yi)，通常的(de)做(zuo)法是(shi)，在(zai)實(shi)驗(yan)時將試劑(ji)從冰箱中拿出來(lai)即(ji)用，而忽略了這種做(zuo)法有可(ke)能(neng)影(ying)響後面(mian)溫育(yu)時(shi)間(jian)不(bu)夠的(de)問題，其直(zhi)接(jie)的(de)後果是(shi)對(dui)壹些弱(ruo)陽(yang)性(xing)標(biao)本的(de)檢測(ce)出(chu)現(xian)假陰(yin)性(xing)。因(yin)此(ci)在(zai)ELISA測(ce)定中試劑(ji)的(de)準備(bei)zui為(wei)關(guan)鍵(jian)的(de)是(shi)，在(zai)實(shi)驗(yan)開(kai)始(shi)前(qian)，將(jiang)試劑(ji)盒先(xian)從冰箱中拿出來(lai)，在(zai)室溫下放置20分(fen)鐘以(yi)上(shang)後(hou)，再進行測(ce)定，以(yi)使試劑(ji)盒在(zai)使用前(qian)與(yu)室溫平衡(heng)。這樣(yang)做(zuo)的(de)目(mu)的(de)，主(zhu)要是(shi)為(wei)了在(zai)後(hou)面(mian)的(de)溫育(yu)反(fan)應步(bu)驟(zhou)中，能使反應微孔內(nei)的(de)溫度能(neng)較(jiao)快(kuai)地(di)達(da)到(dao)所(suo)要(yao)求的(de)高度，以(yi)滿足測(ce)定要求(qiu)。其次(ci)，目(mu)前(qian)的(de)商品(pin)ELISA試劑(ji)盒中的(de)洗板(ban)液均(jun)需在(zai)實(shi)驗(yan)室使用時對(dui)所(suo)提(ti)供的(de)濃縮(suo)液稀(xi)釋配制，因(yin)此(ci)稀(xi)釋時所(suo)用(yong)的(de)蒸餾水或(huo)去離(li)子水(shui)應(ying)保證質(zhi)量。此(ci)外(wai)，當(dang)試劑(ji)盒以(yi)OPD為(wei)底(di)物時(shi)，則底物溶(rong)液應在(zai)反(fan)應(ying)顯(xian)色前(qian)臨(lin)時配(pei)制(zhi)。
三、加(jia)血(xue)清(qing)樣(yang)本(ben)及(ji)反應(ying)試劑(ji)
在(zai)現(xian)在(zai)的(de)ELISA商品(pin)試劑(ji)盒中，血清(qing)樣(yang)本(ben)的(de)加(jia)入(ru)幾乎(hu)是(shi)*的(de)要使用微量加(jia)樣(yang)器加(jia)入(ru)樣(yang)本(ben)的(de)步(bu)驟(zhou)。使用微量加(jia)樣(yang)器加(jia)樣(yang)必(bi)須註意(yi)的(de)關(guan)鍵(jian)點是(shi)：加(jia)樣(yang)不(bu)可太(tai)快(kuai)，要(yao)避(bi)免加(jia)在(zai)孔壁(bi)上(shang)部(bu)，不(bu)可濺出和(he)產(chan)生氣(qi)泡。
加(jia)樣(yang)太(tai)快(kuai)，無法保證微量加(jia)樣(yang)的(de)準確(que)性(xing)和(he)均(jun)壹性(xing)。加(jia)在(zai)孔壁(bi)上(shang)部(bu)的(de)非(fei)包被(bei)區(qu)，易導致(zhi)非(fei)特(te)異(yi)吸(xi)附。濺出會對(dui)鄰近孔產(chan)生汙(wu)染。出現(xian)氣(qi)泡則反應液界(jie)面(mian)有差異。試劑(ji)的(de)加(jia)入(ru)在(zai)國(guo)產(chan)試劑(ji)盒中基本(ben)上(shang)均(jun)是(shi)從滴(di)瓶(ping)中滴(di)加(jia)，除了要註意(yi)滴(di)加(jia)的(de)角度外(wai)，滴(di)加(jia)的(de)速(su)度也很(hen)重(zhong)要，滴(di)加(jia)太(tai)快(kuai)，很(hen)容(rong)易出(chu)現(xian)重(zhong)復滴(di)加(jia)或(huo)加(jia)在(zai)兩孔之間(jian)的(de)現(xian)象(xiang)，這樣(yang)就(jiu)會(hui)在(zai)孔內(nei)的(de)非(fei)包被(bei)區(qu)出現(xian)非(fei)特(te)異(yi)吸(xi)附，從而引起(qi)非(fei)特(te)異(yi)顯(xian)色。所(suo)以(yi)，有時(shi)候(hou)壹(yi)份標本(ben)用相(xiang)同(tong)的(de)試劑(ji)盒這次(ci)測(ce)定為(wei)陽(yang)性(xing)，下次(ci)測(ce)定為(wei)陰(yin)性(xing)，往往就是(shi)上(shang)述(shu)加(jia)樣(yang)及(ji)試劑(ji)的(de)錯誤(wu)所(suo)致(zhi)。
四、溫育(yu)
溫育(yu)是(shi)ELISA測(ce)定中影(ying)響測(ce)定成敗zui為(wei)關(guan)鍵(jian)的(de)壹個(ge)因(yin)素(su)。ELISA作(zuo)為(wei)壹(yi)種固(gu)相(xiang)免疫測(ce)定，抗原抗體的(de)結(jie)合反(fan)應在(zai)固(gu)相(xiang)上(shang)進行，要使液相(xiang)中的(de)抗原或抗體與固相(xiang)上(shang)的(de)特異(yi)抗體或抗原*結(jie)合，必(bi)須在(zai)壹(yi)定的(de)溫度條(tiao)件(jian)下反(fan)應(ying)壹(yi)定的(de)時間(jian)。溫育(yu)所(suo)需時間(jian)與(yu)溫度成反比(bi)，即(ji)溫度越高，則所(suo)需時間(jian)相(xiang)對(dui)較短(duan)。zui為(wei)常(chang)用的(de)溫育(yu)溫度有37℃和(he)室溫，其次(ci)是(shi)43℃和(he)2～8℃。
溫育(yu)這壹步(bu)是(shi)臨(lin)床ELISA測(ce)定中zui容(rong)易出(chu)現(xian)問題的(de)步(bu)驟(zhou)。通常目(mu)前(qian)國(guo)內(nei)ELISA商品(pin)試劑(ji)盒的(de)反應(ying)溫育(yu)時(shi)間(jian)為(wei)37℃ 30分(fen)鐘～小(xiao)時(shi)，進口ELISA試劑(ji)盒則通常為(wei)37℃ ～2小(xiao)時(shi)才能(neng)有較(jiao)*的(de)結(jie)合，低(di)於小(xiao)時(shi)，可(ke)能(neng)會(hui)影(ying)響測(ce)定下限(xian)。因(yin)此(ci)，關(guan)於溫育(yu)，國(guo)產(chan)ELISA試劑(ji)盒在(zai)實(shi)際(ji)測(ce)定操作(zuo)中壹定要註(zhu)意(yi)以(yi)下幾點：
要保證在(zai)設(she)定的(de)溫度下有足夠的(de)反應(ying)時間(jian)。壹(yi)般來(lai)說(shuo)，加(jia)完(wan)樣(yang)本(ben)和(he)/或(huo)反應試劑(ji)後，將微孔板從室溫拿至水(shui)浴箱或溫箱中時，孔內(nei)溫度從室溫升(sheng)至37℃，需要壹(yi)定的(de)時間(jian)，尤其是(shi)在(zai)室溫比(bi)較(jiao)低(di)以(yi)及非(fei)水(shui)浴(yu)的(de)狀(zhuang)態下，這段(duan)升溫時(shi)間(jian)可(ke)能還(hai)比(bi)較(jiao)長(chang)，而在(zai)臨(lin)床實(shi)驗(yan)室中，很(hen)少(shao)有人註(zhu)意(yi)這個問題，通常是(shi)將(jiang)微孔板壹放入溫箱即開(kai)始(shi) 計(ji)時(shi)，這樣(yang)就(jiu)很(hen)容(rong)易造成實際(ji)測(ce)定中溫育(yu)時(shi)間(jian)不(bu)夠，弱(ruo)陽(yang)性(xing)樣(yang)本(ben)測(ce)不(bu)出來(lai)的(de)問題。曾(zeng)有壹(yi)地(di)處(chu)南方的(de)血站(zhan)同(tong)行提(ti)出(chu)了壹個問題，就(jiu)是(shi)在(zai)每(mei)壹年(nian)的(de)冬季(ji)總有那(na)麽壹個(ge)多月的(de)時間(jian)，在(zai)做(zuo)HBsAg測(ce)定的(de)室內(nei)質(zhi)控中，測(ce)定由(you)衛生部臨(lin)床檢驗(yan)中心供應(ying)的(de) ng/ml弱(ruo)陽(yang)性(xing)樣(yang)本(ben)時(shi)，總是(shi)測(ce)不(bu)出來(lai)，不(bu)知(zhi)原因(yin)為(wei)何(he)？這可能(neng)就與(yu)南方冬(dong)天室內(nei)溫度較(jiao)低(di)有關(guan)，此(ci)時(shi)微(wei)孔板轉入溫箱後37℃溫育(yu)時(shi)間(jian)不(bu)夠，以(yi)致(zhi)弱(ruo)陽(yang)性(xing)樣(yang)本(ben)測(ce)定為(wei)陰(yin)性(xing)。