國產(chan)ELISA試劑盒凝(ning)膠(jiao)過濾(lv)實(shi)驗方法

國產(chan)ELISA試劑盒凡(fan)能(neng)催(cui)化同(tong)壹(yi)種化學(xue)反應(ying)，但(dan)其(qi)分子結構(gou)和帶電性質不同的(de)壹組酶(mei)稱同(tong)工(gong)酶(mei)（isoenzyme）。同(tong)工(gong)酶譜的(de)差異(yi)是基(ji)因表達(da)的(de)差異(yi)造(zao)成(cheng)的(de)，所以(yi)在(zai)研(yan)究(jiu)植物基(ji)因調控(kong)與生(sheng)長(chang)發育(yu)及(ji)其(qi)與(yu)環(huan)境(jing)條件(jian)的(de)關(guan)系以(yi)及許(xu)多(duo)生(sheng)理(li)生(sheng)化和遺傳問(wen)題時，常常要分析(xi)同工酶譜的(de)差異(yi)。因此(ci)，同(tong)工酶研(yan)究(jiu)在(zai)理(li)論和實踐(jian)中都(dou)有(you)非(fei)常(chang)重要的(de)意(yi)義(yi)。

壹、原(yuan)理

聚丙烯(xi)酰胺(an)凝(ning)膠(jiao)由丙烯(xi)酰胺(an)和交聯(lian)劑甲(jia)叉雙丙烯(xi)酰胺(an)在(zai)催(cui)化劑作(zuo)用下(xia)聚(ju)合(he)而(er)成(cheng)，具有(you)三(san)維(wei)網(wang)狀(zhuang)結構(gou)，其(qi)網(wang)孔大小(xiao)可(ke)由凝(ning)膠(jiao)濃度(du)和交聯(lian)度(du)加以(yi)調節。凝(ning)膠(jiao)電泳(yong)兼有(you)電荷效應(ying)和分子篩(shai)效應(ying)。被(bei)分離(li)物(wu)質由(you)於(yu)所載電(dian)荷數量(liang)、分子大小(xiao)和形狀(zhuang)的(de)差異(yi)，因此(ci)在(zai)電(dian)泳(yong)時產生(sheng)不(bu)同(tong)的(de)泳(yong)動速率(lv)而(er)相(xiang)互分離(li)。利用特(te)異(yi)性的(de)顏色(se)反應(ying)使(shi)待測酶著色(se)，這(zhe)樣(yang)就(jiu)可(ke)在(zai)凝(ning)膠(jiao)中展(zhan)現出(chu)酶(mei)譜。過氧(yang)化物(wu)酶(mei)是植物體內(nei)常(chang)見(jian)的(de)氧(yang)化酶(mei)。植(zhi)物體(ti)內許(xu)多(duo)生(sheng)理(li)代(dai)謝(xie)過程(cheng)常(chang)與(yu)它的(de)活性及其(qi)同(tong)工(gong)酶的(de)種類(lei)有(you)關(guan)。利用過氧(yang)化物(wu)酶(mei)能(neng)催(cui)化H2O2把聯(lian)苯胺氧(yang)化成(cheng)藍(lan)色或棕(zong)褐(he)色產物(wu)的(de)原(yuan)理，將經(jing)過電(dian)泳(yong)後(hou)的(de)凝(ning)膠(jiao)置(zhi)於有(you)H2O2及聯(lian)苯胺的(de)溶液(ye)染(ran)色，出(chu)現(xian)藍(lan)色或棕(zong)褐(he)色部位(wei)即為(wei)過氧(yang)化物(wu)酶(mei)同工(gong)酶在(zai)凝(ning)膠(jiao)中存在(zai)的(de)位置(zhi)，多條有(you)色帶(dai)即構(gou)成(cheng)過氧(yang)化物(wu)酶(mei)同工(gong)酶譜。本實驗利用連續(xu)的(de)盤狀(zhuang)凝(ning)膠(jiao)電泳(yong)，采用Tris－Gly緩(huan)沖(chong)系統(tong)來分離(li)陰(yin)離(li)子過氧(yang)化物(wu)酶(mei)同工(gong)酶。

二、材(cai)料(liao)、儀器(qi)設(she)備及試劑

（壹(yi)）材(cai)料(liao)：小(xiao)麥(mai)芽

（二(er)）儀(yi)器(qi)設(she)備： .穩流(liu)穩壓(ya)電(dian)泳(yong)儀；2.冷凍(dong)離(li)心機及(ji)離(li)心管；3.成套電泳(yong)槽(cao)（圓盤型(xing)）；4.pH試紙(zhi)；5.其(qi)它常(chang)規用(yong)具。

（三(san)）試劑： .分離(li)膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液(ye)（pH8.9）：mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加(jia)水(shui)定(ding)容(rong)至00ml。2.分離(li)膠(jiao)貯液：30g丙烯(xi)酰胺(an)，0.8g甲(jia)叉雙丙烯(xi)酰胺(an)，加(jia)水(shui)溶(rong)解(jie)並(bing)定(ding)容(rong)至00ml，過濾(lv)後(hou)使用。3.過硫(liu)酸(suan)銨(an)溶(rong)液：過硫(liu)酸(suan)銨(an)0.2g，加(jia)水定(ding)容(rong)至00ml制膠(jiao)時現配(pei)現(xian)用(yong)）。4.濃縮膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液(ye)：mol/L HCl48ml＋Tris5.98g＋TEMED0.46ml，調pH6.7，並定(ding)容(rong)至00ml。5.濃縮膠(jiao)貯備液：丙烯(xi)酰胺(an)0g，甲(jia)叉雙丙烯(xi)酰胺(an)2.5g加(jia)水(shui)定(ding)容(rong)到00ml，使(shi)用前過濾(lv)。6.電(dian)極緩(huan)沖(chong)液(ye)：Tris 6.0g，Gly 28.8g，用(yong)水(shui)定(ding)容(rong)至000ml（pH8.3），用(yong)前稀釋(shi)0倍。7.四(si)甲(jia)基(ji)乙二胺(an)（TEMED）。8.0.%的(de)溴酚(fen)藍(lan)水溶液(ye)。9.聯(lian)苯胺染(ran)色母(mu)液(ye)：聯(lian)苯胺g＋冰醋酸(suan)8ml＋H2O2ml溶解(jie)貯(zhu)於棕色(se)瓶中。

三(san)、國產(chan)ELISA試劑盒實(shi)驗步驟

.安(an)裝(zhuang)電(dian)泳(yong)槽(cao)

2.凝(ning)膠(jiao)的(de)配(pei)制

3.過氧(yang)化物(wu)酶(mei)的(de)提取 稱取g待測植物鮮(xian)樣(yang)置(zhi)於冰浴上(shang)的(de)研(yan)缽(bo)內，加入mlH2O或0.05mol/L Tris－HCl緩(huan)沖(chong)液(ye)（pH6，8）研(yan)成(cheng)勻漿，轉入離(li)心管，再用(yong)2ml前述(shu)溶液(ye)將(jiang)附著在(zai)研(yan)缽(bo)壁上的(de)研(yan)磨(mo)樣(yang)品洗(xi)下(xia)並(bing)全(quan)部(bu)轉入離(li)心管，3500rpm離(li)心5～20min，其(qi)上(shang)清(qing)液即為(wei)酶的(de)提取液，供電泳(yong)分析(xi)用。

4.點樣(yang)：用(yong)微量(liang)註射(she)器(qi)吸取上清(qing)液(ye)，每管加樣(yang)50μl，再分別(bie)加入40%蔗糖溶(rong)液5μl，之後(hou)再用(yong)註射(she)器(qi)將電(dian)極緩(huan)沖(chong)液(ye)慢慢加(jia)入每支(zhi)膠(jiao)管至浸沒(mei)頂(ding)部為(wei)止.zui後(hou)向(xiang)上、下(xia)電(dian)泳(yong)槽(cao)倒(dao)入電極緩(huan)沖(chong)液(ye)（上(shang)槽(cao)必須(xu)淹(yan)沒管頂，下(xia)槽(cao)液(ye)要能(neng)浸泡著凝(ning)膠(jiao)管），zui後(hou)在(zai)上(shang)槽(cao)液(ye)中滴(di)入～2滴(di)溴酚(fen)藍(lan)溶液。

5.電(dian)泳(yong)：將電泳(yong)槽(cao)放(fang)至(zhi)低溫處，在(zai)4℃左(zuo)右(you)，或接(jie)通電(dian)泳(yong)槽(cao)水(shui)冷(leng)卻系統(tong)按上(shang)“壹”下(xia)“＋”接(jie)好(hao)導(dao)線(xian)，通(tong)電，電(dian)泳(yong)開始(shi)電(dian)流(liu)應(ying)低，每管mA，0min後(hou)，再加(jia)大電流(liu)，使(shi)每管達(da)到(dao)2～3mA，當(dang)溴酚(fen)藍(lan)指示劑達(da)到(dao)距管底約(yue)cm處時(shi)，切(qie)斷電流(liu)，停止電泳(yong)。

6.剝膠(jiao)：電泳(yong)完畢，將(jiang)電泳(yong)槽(cao)取出，倒(dao)去緩(huan)沖(chong)液(ye)，取下(xia)凝(ning)膠(jiao)管，放入培(pei)養皿(min)中。用(yong)壹個(ge)帶(dai)有(you)長(chang)針(zhen)頭(tou)的(de)註射(she)器(qi)，吸滿(man)水，將(jiang)針(zhen)頭(tou)沿(yan)管壁插(cha)入，同時(shi)慢慢地將(jiang)註(zhu)射(she)器(qi)中的(de)水推出，並(bing)不(bu)斷轉動凝(ning)膠(jiao)管，將凝(ning)膠(jiao)管擠脫(tuo)出(chu)來，也(ye)可(ke)用(yong)洗(xi)耳球(qiu)擠壓(ya)。

7.染(ran)色：取0.5ml聯(lian)苯胺母(mu)液(ye)＋H2O 9.3ml＋0.2ml3%H2O2，混(hun)勻(yun)後(hou)倒(dao)入盛有(you)凝(ning)膠(jiao)條的(de)培(pei)養皿(min)。此(ci)時(shi)可以看(kan)到(dao)膠(jiao)條上(shang)出現藍(lan)色或棕(zong)褐(he)色環，即過氧(yang)化物(wu)酶(mei)帶，約(yue)十(shi)min後(hou)用自來水(shui)沖洗(xi)，這(zhe)時藍(lan)色帶也(ye)慢慢變(bian)成(cheng)棕褐(he)色。

8.記(ji)錄酶(mei)譜，並計(ji)算各(ge)同(tong)工酶的(de)遷(qian)移(yi)率(lv)。
人(ren)(UK)ELISA試劑盒     進(jin)口(kou)/分裝(zhuang)    Human urokinase，UK ELISA Kit            
人彈性蛋白酶(Elastase)ELISA試劑盒     進(jin)口(kou)/分裝(zhuang)    Human Elastase ELISA Kit            
人白細胞彈性蛋白酶(HLE)ELISA試劑盒     進(jin)口(kou)/分裝(zhuang)    Human leukocyte exastase，HLE ELISA Kit            
人α(AMS/AMY)ELISA試劑盒     進(jin)口(kou)/分裝(zhuang)    Human α-Amylase，AMS/AMY ELISA Kit            
人堿性磷酸酶(ALP)ELISA試劑盒     進(jin)口(kou)/分裝(zhuang)    Human alkaline phosphatase，ALP ELISA Kit 
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