紫(zi)河車LAMP鑒(jian)定(ding)試劑盒(he)使用(yong)方法(fa)

紫(zi)河(he)車(che)LAMP鑒(jian)定(ding)試劑盒(he)使用(yong)方法(fa)：

壹(yi)、樣(yang)品采集(ji)：

1、食品樣(yang)品：樣(yang)品的采集(ji)與(yu)預(yu)培(pei)養(yang)按照樣(yang)品的采集(ji)與(yu)預(yu)培(pei)養(yang)按照《食品衛(wei)生微(wei)生物(wu)學(xue)檢(jian)驗阪(ban)崎(qi)腸(chang)桿菌(jun)檢(jian)驗(yan)要(yao)求進行。

2、血(xue)液(ye)樣(yang)品：用(yong)無(wu)菌(jun)註(zhu)射器(qi)抽(chou)取(qu)受(shou)檢者靜脈血(xue)2mL，註(zhu)入無(wu)菌(jun)EDTA2Na(或(huo)檸檬酸鈉)抗(kang)凝(ning)管(guan)，立即混勻。

3、糞便(bian)樣(yang)品：取(qu)糞便(bian)置於滅(mie)菌(jun)的收(shou)集管(guan)中送檢(jian)。

4、病(bing)竈部位樣(yang)品：取(qu)發(fa)病(bing)部位新鮮(xian)滲(shen)出物(wu)、粘(zhan)液(ye)膿血(xue)送檢(jian)。

壹(yi)、稀(xi)釋 PCR 陽(yang)性對(dui)照（以 10E2-10E7 拷(kao)貝(bei)/μL 這 6 個(ge) 10 倍(bei)稀(xi)釋度為(wei)例(li)）

1. 註(zhu)意：由於(yu)標準(zhun)品濃(nong)度非常高，因(yin)此下(xia)列稀(xi)釋操作(zuo)壹(yi)定要在獨立的區(qu)域(yu)進行，千萬不(bu)能(neng)汙(wu)染(ran)樣(yang)品或(huo)本試劑盒(he)的其他(ta)成(cheng)分(fen)）。為增(zeng)加(jia)產(chan)品穩定(ding)性和避免(mian)擴(kuo)散(san)傳(chuan)染(ran)性(xing)病(bing)原(yuan)，本(ben)產(chan)品不(bu)提供(gong)活體(ti)樣(yang)品做陽(yang)性對(dui)照，只提供(gong)可以直(zhi)接(jie)使用(yong)的 DNA段(duan)作(zuo)為陽(yang)性對(dui)照。

2. 標記(ji) 6 個(ge)離(li)心(xin)管(guan)，分(fen)別(bie)為(wei) 7，6，5，4，3，2。

3. 用(yong)帶(dai)芯槍(qiang)頭(tou)分(fen)別(bie)加(jia)入(ru) 45 μL 熒(ying)光(guang) PCR 模板(ban)稀(xi)釋液(ye)（用(yong)帶(dai)芯槍(qiang)頭(tou)，下(xia)同）。

4. 在(zai) 7 號(hao)管(guan)中加入(ru) 5 μL 1×10E8 拷(kao)貝(bei)/μL 的陽(yang)性對(dui)照，充(chong)分(fen)震蕩(dang) 1 分(fen)鐘，得(de)1×10E7 拷貝(bei)/μL 的陽(yang)性對(dui)照。放冰上(shang)待用(yong)。

5. 換槍(qiang)頭(tou)，在 6 號(hao)管(guan)中加入(ru) 5 μL 1×10E7 拷(kao)貝(bei)/μL 的陽(yang)性對(dui)照(上(shang)步稀(xi)釋所得(de))，充(chong)分(fen)震蕩(dang) 1 分(fen)鐘，得(de) 1×10E6 拷貝(bei)/μL 的陽(yang)性對(dui)照。放冰上(shang)待用(yong)。

6. 換槍(qiang)頭(tou)，在 5 號(hao)管(guan)中加入(ru) 5 μL 1×10E6 拷(kao)貝(bei)/μL 的陽(yang)性對(dui)照到(dao) 5 號(hao)管(guan)中，充(chong)分(fen)震蕩(dang) 1 分(fen)鐘，得(de) 1×10E5 拷貝(bei)/μL 的陽(yang)性對(dui)照。放冰上(shang)待用(yong)。

7. 重(zhong)復上(shang)面(mian)的操(cao)作(zuo)直到(dao)得(de)到(dao) 6 個(ge)稀(xi)釋度的陽(yang)性對(dui)照。放冰上(shang)待用(yong)。

註(zhu)：上(shang)述樣(yang)品建議(yi)經過增(zeng)菌(jun)後，收(shou)集培(pei)養(yang)物(wu)用(yong)於(yu)檢測。 

二(er)、DNA提(ti)取(qu)：

可采用(yong)PCR試劑盒(he)配(pei)備(bei)的DNA抽(chou)提(ti)液(ye)，按以(yi)下(xia)說(shuo)明進行DNA核(he)酸的粗(cu)提(ti)。也可采購(gou)上(shang)海澤(ze)葉(ye)生物(wu)科(ke)技(ji)有(you)限公(gong)司(si)生產(chan)的DNA提(ti)取(qu)試劑盒(he)(過(guo)柱法(fa)-熒(ying)光配(pei)套(tao))或其他(ta)合(he)適(shi)的商業化(hua)產(chan)品，並(bing)按照相(xiang)應(ying)試劑盒(he)說(shuo)明進行操(cao)作。

1、液(ye)體(ti)培(pei)養(yang)物(wu)：取液(ye)體(ti)培(pei)養(yang)物(wu)100μL加到(dao)1.5mL無(wu)菌(jun)離(li)心(xin)管(guan)中，8000rpm離心(xin)3min，盡(jin)量吸棄上(shang)清，加入(ru)50μL DNA抽提(ti)液(ye)充(chong)分(fen)混勻，100℃恒溫(wen)10min，13000rpm離心(xin)3min，取(qu)上(shang)清5μL進行PCR反應。

2、固體(ti)培(pei)養(yang)物(wu)：挑取(qu)單(dan)克隆(long)菌(jun)落(luo)與(yu)50μL DNA抽(chou)提液(ye)充(chong)分(fen)混勻，100℃恒溫(wen)10min，13000rpm離心(xin)3min，取(qu)上(shang)清5μL進行PCR反應。

3、糞(fen)便(bian)樣(yang)品：挑取(qu)米粒(li)大小(xiao)糞便(bian)於滅(mie)菌(jun)離(li)心(xin)管(guan)中，加入(ru)0.5mL生理(li)鹽水，振蕩(dang)混勻，13000rpm離心(xin)3分(fen)鐘，棄上(shang)清，沈(chen)澱(dian)中加(jia)入50μL DNA抽(chou)提(ti)液(ye)充(chong)分(fen)混勻，100℃恒溫(wen)10min，13000rpm離心(xin)3min取(qu)上(shang)清5μL進行PCR反應。

4、其他(ta)液(ye)體(ti)標本(ben)：取標本(ben)2-3mL，13000rpm離心(xin)3min，棄上(shang)清，沈(chen)澱(dian)中加(jia)入50μL DNA抽(chou)提(ti)液(ye)充(chong)分(fen)混勻，100℃恒溫(wen)10min，13000rpm離心(xin)3min取(qu)上(shang)清5μL進行PCR反應。

註(zhu)：陽(yang)性對(dui)照和陰(yin)性對(dui)照為已(yi)經(jing)抽提(ti)好(hao)的核(he)酸(無需(xu)提取(qu))，直(zhi)接(jie)取(qu)5μL加(jia)入(ru)到(dao)反應體(ti)系(xi)中即可。由於(yu)陽(yang)性對(dui)照濃度(du)較(jiao)高，建議(yi)在樣(yang)品制備(bei)區域(yu)加入陽(yang)性對(dui)照。 

APBA1β澱(dian)粉(fen)樣(yang)前(qian)體(ti)蛋白(bai)結(jie)合(he)蛋白(bai)1抗(kang)體(ti)

Apolipoprotein E載(zai)脂(zhi)蛋白(bai)E抗(kang)體(ti)

AFP甲胎蛋白(bai)AFP抗(kang)體(ti)

AE2陰(yin)離子交換蛋白(bai)2抗(kang)體(ti)

Aconitase 1鐵(tie)調節(jie)蛋白(bai)1抗(kang)體(ti)

ATAD3A三(san)磷酸腺苷(gan)酶家族蛋白(bai)3A抗(kang)體(ti)

APOJ載(zai)脂(zhi)蛋白(bai)J抗(kang)體(ti)

APOH載(zai)脂(zhi)蛋白(bai)H抗(kang)體(ti)

ART4二(er)磷酸腺苷(gan)核(he)糖基(ji)轉(zhuan)移(yi)酶(mei)4抗(kang)體(ti)

AKIRIN2AKIRIN2蛋白(bai)抗(kang)體(ti)

ARL8BADP核(he)糖基(ji)化(hua)樣(yang)因(yin)子8B抗(kang)體(ti)

ATAD2三(san)磷酸腺苷(gan)酶家族蛋白(bai)2抗(kang)體(ti)

AKIRIN1AKIRIN1蛋白(bai)抗(kang)體(ti)

ASZ1錨定(ding)蛋白(bai)樣(yang)蛋白(bai)1抗(kang)體(ti)

Adenylate kinase 2腺(xian)苷酸激酶2抗(kang)體(ti)

Acrosin精(jing)子頂體(ti)前(qian)體(ti)蛋白(bai)抗(kang)體(ti)

AIM1L黑(hei)色素瘤缺失樣(yang)蛋白(bai)1抗(kang)體(ti)

AER61未(wei)知(zhi)糖基(ji)化(hua)轉(zhuan)移(yi)酶AER61抗(kang)體(ti)

FE65鐵(tie)蛋白(bai)Fe65抗(kang)體(ti)

ARHI抑(yi)癌基(ji)因(yin)ras同源家族1抗(kang)體(ti)

AP2 alpha轉(zhuan)錄激活蛋白(bai)2α/TFAP2α/AP-2α抗(kang)體(ti)