轉基(ji)因(yin)植物(wu)35S基因(yin)PCR檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒(he)操(cao)作(zuo)步驟(zhou)

轉(zhuan)基(ji)因(yin)植物(wu)35S基因(yin)PCR檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒(he)操(cao)作(zuo)步驟(zhou):

1. 標(biao)準品(pin)的(de)稀釋(shi)與加樣(yang)：在酶標(biao)包(bao)被板上(shang)設(she)標(biao)準品(pin)孔(kong)10孔(kong)，在(zai)di壹(yi)、第二(er)孔(kong)中(zhong)分(fen)別(bie)加標(biao)準品(pin)100μl，然後在(zai)di壹(yi)、第二(er)孔(kong)中(zhong)加標(biao)準品(pin)稀釋(shi)液50μl，混(hun)勻；然後從(cong)di壹(yi)孔(kong)、第二(er)孔(kong)中(zhong)各(ge)取100μl分(fen)別(bie)加到第三孔(kong)和(he)第四(si)孔(kong)，再(zai)在(zai)第三、第四(si)孔(kong)分(fen)別(bie)加標(biao)準品(pin)稀釋(shi)液50μl，混(hun)勻；然後在(zai)第三孔(kong)和(he)第四(si)孔(kong)中(zhong)先各(ge)取50μl棄(qi)掉，再(zai)各(ge)取50μl分(fen)別(bie)取50μl分(fen)別(bie)加到第七(qi)、第八(ba)孔(kong)中(zhong)，再(zai)在(zai)第七(qi)、第八(ba)孔(kong)中(zhong)分(fen)別(bie)加標(biao)準品(pin)稀釋(shi)液50μl，混(hun)勻後(hou)從(cong)第七(qi)、第八(ba)孔(kong)中(zhong)加到第五(wu)、第六孔(kong)中(zhong)，再(zai)在(zai)第五(wu)、第六孔(kong)中(zhong)分(fen)別(bie)加標(biao)準品(pin)稀釋(shi)液50ul，混(hun)勻；混(hun)勻後(hou)從(cong)第五(wu)、第六孔(kong)中(zhong)各(ge)分(fen)別(bie)取50μl加到第九(jiu)、第十(shi)孔(kong)中(zhong)，再(zai)在(zai)第九(jiu)第十(shi)孔(kong)分(fen)別(bie)加標(biao)準品(pin)稀釋(shi)液50μl，混(hun)勻後(hou)從(cong)第九(jiu)第十(shi)孔(kong)中(zhong)各(ge)取50μl棄(qi)掉。（稀釋(shi)後各(ge)孔(kong)加樣(yang)量(liang)都(dou)為(wei)50μl，濃(nong)度(du)分(fen)別(bie)為180 ng/L，120 ng/L ，60 ng/L，30 ng/，15 ng/L）。

2. 加樣(yang)：分(fen)別(bie)設(she)空(kong)白(bai)孔(kong)（空(kong)白(bai)對照(zhao)孔(kong)不(bu)加樣(yang)品(pin)及(ji)酶標(biao)試(shi)劑(ji)，其(qi)余各(ge)步操(cao)作(zuo)相同(tong)）、待(dai)測(ce)樣(yang)品(pin)孔(kong)。在(zai)酶標(biao)包(bao)被板上(shang)待(dai)測(ce)樣(yang)品(pin)孔(kong)中(zhong)先加樣(yang)品(pin)稀釋(shi)液40μl，然後再(zai)加待(dai)測(ce)樣(yang)品(pin)10μl（樣(yang)品(pin)最(zui)終(zhong)稀釋(shi)度(du)為5倍(bei)）。加樣(yang)將(jiang)樣(yang)品(pin)加於(yu)酶標(biao)板孔(kong)底(di)部(bu)，盡(jin)量(liang)不(bu)觸(chu)及孔(kong)壁(bi)，輕輕晃(huang)動(dong)混(hun)勻。

3. 溫育(yu)：用封板(ban)膜(mo)封板(ban)後置37℃溫育(yu)30分(fen)鐘。

4. 配(pei)液：將(jiang)30（48T的(de)20倍(bei)）倍(bei)濃(nong)縮(suo)洗(xi)滌(di)液用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水30（48T的(de)20倍(bei)）倍(bei)稀釋(shi)後備用。

5. 洗(xi)滌(di)：小心揭(jie)掉封板(ban)膜(mo)，棄(qi)去液體，甩(shuai)幹(gan)，每孔(kong)加滿洗(xi)滌(di)液，靜(jing)置(zhi)30秒(miao)後(hou)棄(qi)去，如此重(zhong)復5次(ci)，拍(pai)幹(gan)。

6. 加酶：每孔(kong)加入酶標(biao)試(shi)劑(ji)50μl，空(kong)白(bai)孔(kong)除(chu)外。

7. 溫育(yu)：操(cao)作(zuo)同(tong)3。

8. 洗(xi)滌(di)：操(cao)作(zuo)同(tong)5。

9. 顯(xian)色：每(mei)孔(kong)先加入顯(xian)色劑(ji)A50μl，再(zai)加入顯(xian)色劑(ji)B50μl，輕輕震(zhen)蕩(dang)混(hun)勻，37℃避(bi)光(guang)顯(xian)色15分(fen)鐘.

10. 終止：每(mei)孔(kong)加終止液(ye)50μl，終(zhong)止反應（此(ci)時(shi)藍(lan)色立(li)轉(zhuan)黃(huang)色）。

11. 測(ce)定(ding)：以(yi)空(kong)白(bai)空(kong)調(tiao)零，450nm波長(chang)依序測(ce)量(liang)各(ge)孔(kong)的(de)吸(xi)光(guang)度(du)（OD值）。 測(ce)定(ding)應(ying)在(zai)加終止液(ye)後(hou)15分(fen)鐘。