植(zhi)物(wu)RNAout

植(zhi)物(wu)RNAout
產品及特點 本(ben)產品是天(tian)澤基因自主開(kai)發(fa)的(de)*產品，其原理(li)*不(bu)同(tong)於異硫氰酸(suan)胍/酚(fen)/氯仿提(ti)取方法，克(ke)服(fu)了後(hou)者不能區分(fen)RNA （本(ben)質(zhi)上是多糖(tang)）和(he)其他(ta)植(zhi)物(wu)多(duo)糖的(de)缺點，能(neng)將(jiang)RNA和(he)其他(ta)植(zhi)物(wu)多(duo)糖分(fen)開(kai)，同(tong)時(shi)還(hai)能有(you)效去除多(duo)酚(fen)和(he)其他(ta)植(zhi)物(wu)次級代(dai)謝(xie)成份(fen)。其有(you)效性(xing)在近(jin)五十(shi)多種各(ge)類(lei)植(zhi)物(wu)（見(jian)附錄，包括(kuo)十(shi)分(fen)棘(ji)手的(de)松(song)柏(bai)類(lei)植(zhi)物(wu)）中(zhong)得到驗證。
. 適(shi)用於(yu)絕大(da)多(duo)數(shu)植(zhi)物(wu)，從(cong)五十(shi)多種植(zhi)物(wu)材(cai)料中都成功(gong)提(ti)取到了總RNA，其中包括(kuo)松(song)針、柏樹、香蕉等用胍(gua)/酚(fen)/氯仿方法(fa)未(wei)能提(ti)取到RNA的(de)植(zhi)物(wu)（註(zhu)：部分(fen)植(zhi)物(wu)組(zu)織(zhi)，如(ru)果(guo)實， RNase含(han)量(liang)*, 需(xu)要另(ling)外加(jia)RVC抑(yi)制其活性(xing)）。
2. 操作(zuo)簡單快(kuai)速，zui短可(ke)以(yi)只需(xu)要約十(shi)五分(fen)鐘(zhong)，可(ke)以(yi)全(quan)在(zai)室溫(wen)下(xia)進(jin)行。
3. 得到的(de)RNA平均 OD260/280在(zai).9左右(you)，可(ke)直(zhi)接(jie)用於(yu)RT-PCR和(he)Northern等研究(jiu)。
規(gui)格及成分(fen) 成份(fen) 50 次包裝(zhuang) 250 次包裝(zhuang)
溶(rong)液(ye)A 50 mL 250 mL
溶(rong)液(ye)B 5 mL 75 mL
溶(rong)液(ye)C 25 mL 25 mL
溶(rong)液(ye)D 25 mL 25 mL
使(shi)用手(shou)冊(ce) 份(fen) 份

運輸(shu)及保(bao)存 常(chang)溫(wen)運(yun)輸(shu)，4℃保(bao)存，有(you)效期(qi)壹(yi)年。
自備試劑(ji) 氯仿、75%乙醇(chun)、RNA溶(rong)解(jie)液(ye)。
使(shi)用方(fang)法 . 準(zhun)備
a） 估算試(shi)劑(ji)和(he)組(zu)織(zhi)細胞(bao)的(de)用量(liang)並準(zhun)備足(zu)夠(gou)的(de)氯仿、75%乙醇(chun)和(he)RNA溶(rong)解(jie)液(ye) （如(ru)RNASAVER、無RNase的(de)水或有(you)滅(mie)活(huo)殘(can)留(liu)RNase活(huo)性(xing)的(de)液(ye)相RNase清除劑(ji)）。每(mei)次微量提(ti)取壹般(ban)需(xu)要00-200 mg植(zhi)物(wu)葉片、或50-00 mg植(zhi)物(wu)種子、或200-500 mg植(zhi)物(wu)果(guo)實。
b） 溶(rong)解(jie)溶(rong)液(ye)A沈(chen)澱。溶(rong)液(ye)A在(zai)4℃放(fang)置後(hou)可(ke)能(neng)會(hui)產生(sheng)沈(chen)澱，使用前必(bi)須(xu)放(fang)在65℃水浴(yu)使(shi)沈(chen)澱*溶(rong)解(jie)。
2、 勻漿
a） 先(xian)將(jiang)新(xin)鮮(xian)植(zhi)物(wu)切(qie)成小(xiao)塊(kuai)（保(bao)存在(zai)RNALOCKER中的(de)植(zhi)物(wu)組(zu)織(zhi)需(xu)用紙(zhi)吸去RNALOCKER液(ye)體後再(zai)剪(jian)切(qie)成小(xiao)塊(kuai)），放(fang)入0-5 mL塑(su)料離心(xin)管中，加(jia)入 mL溶(rong)液(ye)A，然後(hou)用勻漿器(qi)勻漿5-20秒(miao)，將(jiang)不超(chao)過 mL的(de)勻漿液(ye)轉(zhuan)移(yi)至幹凈的(de).5 mL塑料(liao)離(li)心(xin)管中（可(ke)以(yi)不必(bi)轉(zhuan)移(yi)非液(ye)體的(de)細胞(bao)碎片）。勻漿時(shi)會(hui)產生(sheng)泡(pao)沫，但(dan)不(bu)影(ying)響(xiang)提(ti)取效果(guo)。有(you)的(de)植(zhi)物(wu)組(zu)織(zhi)（果(guo)實）含(han)有(you)大(da)量(liang)水份(fen)，勻漿液(ye)會(hui)多於 mL，轉(zhuan)移(yi)時(shi)也(ye)只取 mL。
b） 如(ru)果(guo)用硯(yan)磨(mo)法破(po)碎植(zhi)物(wu)組(zu)織(zhi)，需(xu)將(jiang)植(zhi)物(wu)組(zu)織(zhi)浸(jin)泡在 mL溶(rong)液(ye)A中(zhong)再硯(yan)磨(mo)，盡量(liang)避免植(zhi)物(wu)組(zu)織(zhi)跟空氣(qi)直(zhi)接(jie)接(jie)觸(chu)，然後(hou)將(jiang)硯(yan)磨(mo)物(wu)轉(zhuan)移(yi)到(dao)新(xin)的(de).5 mL離心(xin)管中。
3、 *次分(fen)相
a） 在裝(zhuang)有(you)裂解物(wu)的(de)離心(xin)管中加(jia)入0.3 mL的(de)溶(rong)液(ye)B和(he)0.2 mL自備氯仿，用手(shou)上下(xia)顛(dian)倒或振(zhen)蕩(dang)器(qi)振(zhen)蕩(dang)30秒(miao)混勻，此(ci)時(shi)溶(rong)液(ye)呈(cheng)均勻的(de)乳濁狀。振(zhen)蕩(dang)器(qi)振(zhen)蕩(dang)時(shi)必(bi)須(xu)使管(guan)底(di)溶(rong)液(ye)震蕩(dang)起(qi)來(lai)。
b） 室溫(wen)2000-5000 g離(li)心(xin)5分(fen)鐘(zhong)，兩相間將(jiang)有(you)約5-0毫(hao)米(mi)厚(hou)的(de)細胞(bao)破(po)碎物(wu)。
c） 將(jiang)上清液(ye)（約0.8 mL）轉(zhuan)移(yi)到(dao)另(ling)壹幹(gan)凈的(de).5 mL塑料(liao)離(li)心(xin)管中，下(xia)層(ceng)有(you)機(ji)相和(he)中間層(ceng)含有(you)DNA、蛋(dan)白(bai)質和(he)其他(ta)雜(za)質，避免觸(chu)及或吸取。留下(xia)00 uL上(shang)清液(ye)不(bu)取。
4、 第二次分(fen)相
a） 在上(shang)清液(ye)中(zhong)加入0.5 mL的(de)溶(rong)液(ye)C和(he)0.2 mL的(de)自備氯仿，用手(shou)上下(xia)顛(dian)倒或振(zhen)蕩(dang)器(qi)振(zhen)蕩(dang)30秒(miao)混勻，此(ci)時(shi)溶(rong)液(ye)呈(cheng)均勻的(de)乳濁狀。振(zhen)蕩(dang)器(qi)振(zhen)蕩(dang)時(shi)必(bi)須(xu)使管(guan)底(di)溶(rong)液(ye)震蕩(dang)起(qi)來(lai)。
b） 室溫(wen)2000-5000 g離(li)心(xin)3分(fen)鐘(zhong)，兩相間將(jiang)有(you)白(bai)色(se)膜狀物(wu)（蛋(dan)白(bai)質）形(xing)成。
c） 將(jiang)上清液(ye)（約 mL）轉(zhuan)移(yi)到(dao)另(ling)壹幹(gan)凈的(de).5 mL塑料(liao)離(li)心(xin)管中,避免觸(chu)及或吸取有(you)機(ji)相及其上面的(de)白(bai)色(se)膜狀物(wu)。
5、 沈(chen)澱
a） 在上(shang)清液(ye)中(zhong)加入0.5倍體積的(de)溶(rong)液(ye)D，用手(shou)上下(xia)顛(dian)倒或振(zhen)蕩(dang)器(qi)振(zhen)蕩(dang)30秒(miao)混勻，此(ci)時(shi)溶(rong)液(ye)呈(cheng)白(bai)色(se)渾(hun)濁狀。振(zhen)蕩(dang)器(qi)振(zhen)蕩(dang)時(shi)必(bi)須(xu)使管(guan)底(di)溶(rong)液(ye)震蕩(dang)起(qi)來(lai)。如(ru)果(guo)提(ti)取 50 mg以(yi)下(xia)的(de)微量植(zhi)物(wu)組(zu)織(zhi)樣品，在此(ci)步(bu)加入天(tian)澤基因的(de)微量助沈(chen)劑(ji)RNADOWN。
b） 室溫(wen)2000-5000 g離(li)心(xin)3-5分(fen)鐘(zhong)，RNA將(jiang)在管(guan)底(di)形成白(bai)色(se)沈(chen)澱（約黃(huang)豆(dou)大(da)小(xiao)）。如(ru)果(guo)組(zu)織(zhi)樣品量少或需(xu)要提(ti)高RNA回收(shou)率(lv)，也可(ke)以(yi)延長(chang)離(li)心(xin)時(shi)間(jian)到20-30分(fen)鐘(zhong)。
c） 小心(xin)移(yi)棄(qi)上清液(ye)，避免觸(chu)及管(guan)底(di)RNA沈(chen)澱。
註(zhu)意：如(ru)果(guo)加入溶(rong)液(ye)D離(li)心(xin)後沈(chen)澱漂(piao)浮(fu)在上(shang)面，說(shuo)明植(zhi)物(wu)糖(tang)份多，溶(rong)液(ye)比(bi)重大(da)，可(ke)以(yi)少加植(zhi)物(wu)樣品，也可(ke)以(yi)適(shi)當(dang)加無(wu)RNase的(de)水稀釋(shi)直(zhi)到(dao)沈(chen)澱能夠(gou)沈(chen)下(xia)去為止(zhi)。如(ru)果(guo)離心(xin)後管底(di)有(you)類(lei)似(si)氯仿的(de)相出現，說(shuo)明上壹步離(li)心(xin)時(shi)間(jian)不夠(gou)或取上清時(shi)取到了下(xia)層(ceng)的(de)有(you)機(ji)相，可(ke)以(yi)適(shi)當(dang)延長(chang)離(li)心(xin)時(shi)間(jian)或取上清時(shi)留(liu)下(xia)約00 uL不取或在第四步時(shi)加(jia)0.3 mL的(de)自備氯仿。
6、 *次清洗
a） 在離(li)心(xin)管中加(jia)入mL 75%的(de)乙醇(chun)，振(zhen)蕩(dang)器(qi)上(shang)振(zhen)蕩(dang)混(hun)均(jun)30秒(miao)。
b） 室溫(wen)2000-5000 g離(li)心(xin)分(fen)鐘(zhong)，RNA將(jiang)在管(guan)底(di)形成細(xi)小(xiao)沈(chen)澱（約芝麻大(da)小(xiao)）。
c） 小(xiao)心(xin)吸棄上(shang)清液(ye),註(zhu)意不(bu)要吸棄RNA沈(chen)澱。
7、 第二次清洗
a） 重復第六步壹(yi)次。
b） 短暫(zan)快(kuai)速離(li)心(xin)，用移(yi)液(ye)槍(qiang)小(xiao)心(xin)吸棄殘(can)留(liu)液(ye),註(zhu)意不(bu)要吸棄沈(chen)澱。此步(bu)將(jiang)有(you)效去除殘(can)留(liu)的(de)乙醇(chun)，否(fou)則(ze)後續(xu)反(fan)應會(hui)受到影(ying)響(xiang)。
8、 溶(rong)解(jie)
a） 加(jia)入(ru)適(shi)量（壹(yi)般(ban)為20-00 μL） RNA溶(rong)解(jie)液(ye)使(shi)RNA沈(chen)澱溶(rong)解(jie)，存放(fang)於-80℃或立即(ji)使(shi)用。千萬(wan)不(bu)要用真(zhen)空離(li)心(xin)法使RNA沈(chen)澱過於(yu)幹(gan)燥,否(fou)則(ze)RNA將(jiang)變(bian)得十(shi)分(fen)難(nan)溶(rong)。
9、 檢(jian)測(ce)
a） RNA完(wan)整(zheng)性(xing)的(de)電泳檢測
如(ru)果(guo)需(xu)要做Northern雜(za)交，強烈(lie)建(jian)議用戶(hu)使用甲(jia)醛變(bian)性(xing)膠(jiao)進(jin)行RNA電(dian)泳，因為非變(bian)性(xing)膠(jiao)不(bu)能(neng)分(fen)離(li)所(suo)有(you)的(de)RNA分(fen)子（BioTechniques，28：44，2000）。如(ru)果(guo)是簡單檢測，可(ke)以(yi)使用TAE或天(tian)澤基因的(de)SuperBuffer-2 DNA/RNA兩用快(kuai)速電(dian)泳液(ye)，但(dan)文獻報道必(bi)須(xu)使用變(bian)性(xing)上樣液(ye)（BioTechniques，9：558，990）。普通DNA上樣液(ye)不(bu)含變(bian)性(xing)劑，也(ye)沒經(jing)過去RNase處理(li)，所(suo)以(yi)不要使用。
尤其需(xu)要註(zhu)意的(de)是不(bu)要使用TBE進(jin)行RNA電(dian)泳，因為TBE所(suo)含硼(peng)酸(suan)是研究(jiu)多糖(tang)的(de)經典(dian)方(fang)法(fa)----硼(peng)酸(suan)絡(luo)合法中(zhong)的(de)關(guan)鍵(jian)成分(fen)，硼(peng)酸(suan)通過(guo)與RNA核糖中的(de)羥基(ji)發(fa)生(sheng)絡(luo)合反(fan)應，形(xing)成RNA分(fen)子內或RNA分(fen)子間的(de)絡(luo)合復合物(wu)，使(shi)同(tong)樣長度的(de)RNA具有(you)不(bu)同(tong)的(de)泳動速度，電(dian)泳條(tiao)帶(dai)彌散，同(tong)時(shi)有(you)大(da)的(de)RNA絡(luo)合復合物(wu)遲(chi)留在(zai)加樣孔中（壹般(ban)會(hui)誤以(yi)為是(shi)基(ji)因組(zu)DNA汙染）。RNA分(fen)子內或RNA分(fen)子間的(de)絡(luo)合物(wu)的(de)形成的(de)多少和(he)比例又(you)與硼(peng)酸(suan)與RNA的(de)數量(liang)比(bi)例(li)有(you)關(guan)，而RNA樣品中汙(wu)染的(de)其他(ta)多(duo)糖(tang)（如(ru)植(zhi)物(wu)中(zhong)提(ti)取的(de)RNA）也會(hui)參與此反(fan)應，使(shi)硼(peng)酸(suan)對RNA電泳的(de)影(ying)響(xiang)更(geng)復雜(za)，所(suo)以(yi)TBE對RNA電泳的(de)影(ying)響(xiang)沒有(you)規(gui)律性(xing)和(he)重復性(xing)。有(you)的(de)樣品可(ke)以(yi)使用有(you)的(de)又(you)不行，是(shi)避免使用。
由於動物(wu)細(xi)胞中70-80%的(de)RNA為rRNA，後(hou)者(zhe)又(you)由28S （約4800 nt），8S （約900 nt）和(he)5.8S （約20 nt）三種組(zu)成，所(suo)以(yi)變(bian)性(xing)膠(jiao)電(dian)泳後應該在UV下(xia)看(kan)見(jian)三條(tiao)清晰的(de)rRNA帶(dai)。由於核酸(suan)長度(du)與結合EB的(de)數量(liang)成正(zheng)比(bi)（當(dang)然還(hai)與RNA的(de)二級結(jie)構有(you)關(guan)，雙(shuang)鏈部(bu)分(fen)結(jie)合能力(li)比(bi)單鏈部(bu)分(fen)強），所(suo)以(yi)28S rRNA條(tiao)帶(dai)的(de)熒光強度(du)壹(yi)般(ban)比8S rRNA條(tiao)帶(dai)的(de)熒光強度(du)強.5-2.3倍(bei)。如(ru)果(guo)這(zhe)兩條(tiao)rRNA帶(dai)不清晰或比例(li)小(xiao)於此範(fan)圍則(ze)表示(shi)RNA有(you)降(jiang)解(jie)（因為大(da)的(de)RNA被酶(mei)降(jiang)解(jie)的(de)可(ke)能(neng)更(geng)大(da)）。
跟(gen)動(dong)物(wu)壹(yi)樣，植(zhi)物(wu)果(guo)實和(he)種子的(de)RNA壹般(ban)有(you)三條(tiao)電泳帶(dai)，但(dan)植(zhi)物(wu)葉片的(de)RNA有(you)四(si)條(tiao)或更(geng)多(duo)rRNA帶(dai)，多余(yu)的(de)RNA來(lai)源於葉片中(zhong)大(da)量(liang)存在(zai)的(de)葉綠體。
b） RNA產量(liang)產率(lv)測(ce)定
將(jiang)5-0 μL RNA溶(rong)於(yu)TE緩(huan)沖液(ye)中(zhong)（pH7.5-8.2之間）檢測(ce)其在OD260的(de)光吸(xi)收(shou)。通(tong)過光吸(xi)收(shou)可(ke)以(yi)得出RNA濃度（ OD260的(de)RNA=40 μg/mL），進(jin)而計(ji)算出(chu)RNA的(de)產量(liang)（濃(nong)度X體積）和(he)產率(lv)（RNA產量(liang)/組(zu)織(zhi)用量(liang)）。
註(zhu)意不(bu)要將(jiang)RNA稀釋(shi)在DEPC水中(zhong)檢(jian)測OD260和(he)OD280，否(fou)則(ze)光吸(xi)收(shou)比(bi)在TE中測得的(de)低(di)0%-5%，因為核(he)酸(suan)光吸(xi)收(shou)跟(gen)溶(rong)液(ye)pH相關(guan)，而DEPC水中(zhong)的(de)DEPC高壓(ya)分(fen)解(jie)後產生(sheng)的(de)CO2 與水反(fan)應生(sheng)成碳(tan)酸(suan)，使溶(rong)液(ye)pH降(jiang)低(di)進(jin)而降(jiang)低(di)RNA的(de)光吸(xi)收(shou)。RNA的(de)產率(lv)還(hai)隨(sui)組(zu)織(zhi)的(de)營養狀態和(he)組(zu)織(zhi)的(de)種類(lei)不(bu)同(tong)而不(bu)同(tong)，00 mg種子的(de)RNA產量(liang)壹(yi)般(ban)為00-20 μg，00 mg葉片為(wei)30-60 μg, 00 mg果(guo)實為(wei)20-40 μg。
c） RNA純(chun)度(du)測定
無汙(wu)染的(de)總RNA的(de)OD260/OD280壹般(ban)在.8-2.之(zhi)間(jian)（具體數值與其堿基組(zu)成和(he)溶(rong)液(ye)成分(fen)等多種因素有(you)關(guan)），OD260/OD230壹(yi)般(ban)在2.0-2.3之(zhi)間(jian)，如(ru)果(guo)低(di)於(yu)或高於此(ci)範圍則(ze)分(fen)別表(biao)示(shi)樣品可(ke)能(neng)有(you)蛋(dan)白(bai)質或多糖(tang)的(de)汙染，但(dan)壹(yi)般(ban)不影(ying)響(xiang)RT-PCR等反(fan)應。蛋(dan)白(bai)質汙(wu)染可(ke)以(yi)通過(guo)酚(fen)/氯仿抽提(ti)壹次然後(hou)酒(jiu)精(jing)沈(chen)澱去除，DNA和(he)多糖汙(wu)染可(ke)以(yi)分(fen)別用天(tian)澤基因的(de)DNA Erasol 和(he)PS Erasol去除。