谷(gu)研(yan)試劑-熒光(guang)素(su)FITC標記抗體的(de)方法

                              谷研(yan)試劑-熒光(guang)素(su)FITC標記抗體的(de)方法

常(chang)用(yong)Marsshall(958)法標記熒光抗(kang)體，也(ye)可以(yi)根(gen)據條(tiao)件采(cai)用(yong)Chadwick等(deng)標記法或(huo)Clark等(deng)(963)的透析標記法。

    ．Marsshall法

    ()材料(liao)    抗(kang)體(ti)球(qiu)蛋(dan)白溶(rong)液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽緩沖(chong)液、無(wu)菌生理鹽水(shui)、異(yi)硫(liu)氰(qing)酸熒光(guang)

素(su)、％硫(liu)柳(liu)汞(gong)水(shui)溶(rong)液(ye)、50ml小(xiao)燒(shao)杯(bei)、4℃冰箱(xiang)、電磁(ci)攪拌器、透析袋、玻棒(bang)、pH7．2或(huo)

3．0的(de)0．0mol／LPBS等。

    (2)方法及(ji)步(bu)驟(zhou)    ①抗(kang)體(ti)的(de)準備  取適(shi)量已知(zhi)濃(nong)度(du)的(de)球蛋(dan)白溶(rong)液於燒(shao)杯(bei)中，再加人生理鹽水(shui)及(ji)碳酸鹽緩沖(chong)液，使zui後(hou)免(mian)疫(yi)球(qiu)蛋(dan)白濃(nong)度為20mg／ml，碳酸鹽緩沖(chong)液容量為(wei)總(zong)量(liang)的／0，混勻(yun)，將(jiang)燒(shao)瓴(ling)置(zhi)電磁(ci)攪拌器上(速(su)度適(shi)當以(yi)不(bu)起(qi)泡(pao)沫(mo)為(wei)宜(yi))5～0min。

    ②熒光(guang)素(su)的(de)準(zhun)備  根據欲(yu)標記的蛋(dan)白質(zhi)總(zong)量(liang)，按(an)每(mei)毫(hao)克(ke)免(mian)疫(yi)球蛋(dan)白加(jia)0．0mg熒光色素(su)，用(yong)分(fen)析天平準(zhun)確(que)稱(cheng)取所(suo)需(xu)的異硫氰(qing)酸熒光(guang)素(su)粉(fen)末(mo)。也(ye)可用(yong)下(xia)述公式計(ji)算(suan)出(chu)免(mian)疫(yi)球蛋(dan)白、熒(ying)光素(su)的(de)量(liang)，還(hai)可以(yi)算(suan)出需(xu)加(jia)緩(huan)沖(chong)液的(de)量。

    a．蛋(dan)白溶(rong)液：含(han)量Amg／m；容積(ji)Bml。

    b．總(zong)蛋(dan)白量(liang)(AXB)＝Crag。

    c．C／20～C／0＝Dmg(如蛋(dan)白含(han)量低(di)於20mg／ml，用(yong)C／0；如(ru)高(gao)於20mg／ml，用(yong)C／20)。

    d．熒(ying)光素(su)FITC的(de)量(liang)：(／50～2／00)XC＝Emg。

    e．巳(si)0．5mol／L(pH9．5)碳酸鹽緩沖(chong)液D／0＝Fml。

    f． PBS量(liang)D-(B+F)=Gml。

    註：A為(wei)蛋(dan)白含(han)量，mg／ml；B為(wei)蛋(dan)白質(zhi)溶液的容積(ji)；C為(wei)蛋(dan)白總(zong)量(liang)，mg；D為常數(shu)，mg；正為熒光素(su)的(de)量(liang)，mg；F為(wei)碳酸鹽緩沖(chong)液的(de)容積(ji)，ml；G為(wei)PBS的容積(ji)，ml。

    ③結(jie)合(或(huo)標記)  邊攪拌邊(bian)將(jiang)稱(cheng)取的(de)熒光(guang)色素(su)漸(jian)漸(jian)加入(ru)球蛋(dan)白溶(rong)液中，避免(mian)將(jiang)熒(ying)光(guang)素(su)粘於燒(shao)瓶(ping)壁(bi)(大約在(zai)5—0min內(nei)加(jia)完)，加(jia)完後(hou)，繼(ji)續避光(guang)攪拌2h左右(you)。結合(he)期間(jian)應(ying)保(bao)持(chi)蛋(dan)白溶(rong)液於4℃左右(you)，故需將(jiang)燒(shao)杯(bei)和(he)攪拌器壹(yi)起(qi)移人4℃冰箱(xiang)中。

    ④透析  結合完畢後(hou)，將(jiang)標記的球蛋(dan)白溶(rong)液離心(2500r／min)20rain，除(chu)去(qu)其中少量的(de)沈(chen)澱物，裝入透(tou)析袋中，再置於燒(shao)杯(bei)中，用(yong)pH8．0緩(huan)沖(chong)鹽水(shui)透(tou)析(0～4~C)過夜。

    ⑤過柱  取(qu)透(tou)析過夜的標記物，通(tong)過(guo)葡(pu)聚糖凝(ning)膠(jiao)SephadexG-25或(huo)G—50柱，分(fen)離遊離熒(ying)光素(su)，收(shou)集標記的熒光(guang)抗體(ti)進(jin)行(xing)鑒定(ding)。洗脫(tuo)液：0．0mol／L磷(lin)酸鹽緩沖(chong)液(pH7．2)；過(guo)濾量(liang)：2ml標記蛋(dan)白液(ye)(過濾前未透析)；收(shou)集量(liang)：20ml(稀釋(shi)．7倍(bei)左右(you))。

    2．Chadwick法

    ()試劑和(he)材料(liao)    抗(kang)體(ti)球(qiu)蛋(dan)白溶(rong)液、異硫氰酸熒光(guang)素(su)、3%碳酸鈉水(shui)溶(rong)液(ye)、0．0mol/L pH8.0PBS、%硫(liu)柳(liu)汞(gong)、離心機(ji)及(ji)離心管(guan)、燒杯(bei)（25ml）攪拌器、無(wu)菌吸管(guan)，無(wu)菌吸管(guan)及毛(mao)細(xi)滴(di)管(guan)、燒杯(bei)（500ml）透析袋等(deng)。

    (2)方法及(ji)步(bu)驟(zhou)    ①抗(kang)體(ti)準(zhun)備  用(yong)o～4~C的(de)pH8。0磷(lin)酸鹽緩沖(chong)鹽水(shui)將(jiang)球(qiu)蛋(dan)白溶(rong)液稀釋(shi)至(zhi)濃度(du)為30～40mg／ml，置(zhi)入25ml燒杯(bei)內(nei)，放(fang)於冰(bing)槽(cao)中。

    ②熒光色素(su)準(zhun)備  按(an)每(mei)毫(hao)克(ke)免(mian)疫(yi)球蛋(dan)白加(jia)入熒光素(su)0．0rug計(ji)算(suan)，稱(cheng)取所(suo)需(xu)的熒光素(su)，用(yong)3％碳酸鈉水(shui)溶(rong)液(ye)溶(rong)解(jie)。

    ③將(jiang)準(zhun)備的抗體(ti)與(yu)熒光(guang)色素(su)溶(rong)液(ye)等(deng)量(liang)混合(he)，充(chong)分(fen)攪勻，在(zai)o～4~C冰箱(xiang)中結合(在(zai)磁力攪拌機(ji)上持(chi)續攪拌)8～24h。

    ④透(tou)析和(he)柱層(ceng)析  方法同(tong)Marsshall法。

    3．改良(liang)法

    ()試劑和(he)材料(liao)    ①0．0mol／L(pH7．2)PBS配(pei)法中，校定pH至(zhi)7．2。NaCi 8g、Na2HP04 ．5g，溶於2000ml蒸(zheng)餾水(shui)

    ②0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽緩沖(chong)液配(pei)法  取(qu)0．5mol／LNazCOs(5．3％)0ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合(he)後(hou)，校定pH至(zhi)9．0。

    ③3％碳酸鈉水(shui)溶(rong)液(ye)配(pei)法  稱(cheng)L 5g充(chong)分(fen)溶解(jie)於50ml滅菌蒸(zheng)餾水(shui)中即成(cheng)。

    ④其他(ta)試劑和(he)材料(liao)  l％*、離(li)心機(ji)及(ji)離心管(guan)、燒杯(bei)(25m)、攪拌器、無(wu)菌吸管(guan)及毛(mao)細(xi)滴(di)管(guan)、燒杯(bei)(500m)透析袋等(deng)。

    (2)方法及(ji)步(bu)驟(zhou)    ①取(qu)價的抗(kang)人球蛋(dan)白兔免(mian)疫(yi)血清，分(fen)離球蛋(dan)白，用(yong)鹽水(shui)(0．5mol／LNaCl)及(ji)緩(huan)沖(chong)液(0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀釋(shi)使每(mei)毫(hao)升內(nei)含(han)蛋(dan)白質(zhi)lOmg，緩沖(chong)液為(wei)總(zong)量(liang)的0％，降溫(wen)至(zhi)4℃。

    ②加入(ru)異硫(liu)氰酸鹽(FITC)熒光(guang)素(su)[蛋(dan)白：熒(ying)光素(su)＝(50—80)mg‘lmg]，在(zai)0～4~C

下(xia)電磁(ci)攪拌2～4h。

    ③然(ran)後(hou)用(yong)半(ban)飽和(he)的(de)硫(liu)酸銨(an)將(jiang)標記球蛋(dan)白沈(chen)澱分(fen)離，除去(qu)未結合(he)的(de)熒(ying)光素(su)，再(zai)用(yong)緩(huan)沖(chong)鹽水(shui)透(tou)析，除去硫酸銨(an)(用(yong)Nessler試劑測(ce)驗(yan)，至(zhi)隔(ge)夜(ye)透析的鹽水(shui)無(wu)氨離(li)子及(ji)熒光(guang)色(se)素(su)為(wei)止)。

    ④將(jiang)制備好的熒(ying)光(guang)抗(kang)體(ti)加(jia)*o．0％，分(fen)裝在(zai)lml安瓿(bu)中，或(huo)凍(dong)幹(gan)，保(bao)存於冰(bing)箱(xiang)中(4℃)可以(yi)用(yong)半(ban)年以(yi)上，壹(yi)20~C保(bao)存可達(da)2年(nian)以上。

    4．透析標記法

   此(ci)法適(shi)用(yong)於小(xiao)量(liang)抗體(ti)的熒光素(su)標記，標記簡(jian)便(bian)，非特(te)異(yi)性染色(se)較少。

   ()試劑和(he)材料(liao)   試劑和(he)材料(liao)同(tong)改良(liang)法。

   (2)方法及(ji)步(bu)驟(zhou)   ①用(yong)0．025mol／L碳酸鹽緩沖(chong)液pH9．0，將(jiang)欲(yu)標記免疫球(qiu)蛋(dan)白稀釋(shi)成(cheng)％濃度，裝(zhuang)入透析袋中。

   ②用(yong)同(tong)壹(yi)緩沖(chong)液將(jiang)FITC配(pei)成(cheng)0．mg／ml的溶液(ye)，按(an)0mg／ml球(qiu)蛋(dan)白溶(rong)液體積(ji)的(de)0倍，將(jiang)FITC稀釋(shi)液(ye)盛於圓(yuan)柱形(xing)容器內(nei)，並使透(tou)析袋浸(jin)沒於FITC液(ye)中。

   ③容器頂(ding)端蓋緊(jin)，底部放(fang)攪拌棒(bang)，在(zai)4~C電磁(ci)攪拌下(xia)透析標記24h。取出透(tou)析袋中標記液，即刻用(yong)SephadexG50凝(ning)膠(jiao)過濾，去除遊離熒(ying)光素(su)，分(fen)裝，貯(zhu)存於4℃中。