谷(gu)研(yan)試(shi)劑(ji)-FITC（異(yi)硫氰(qing)酸熒(ying)光(guang)素(su)）

                               谷(gu)研(yan)試(shi)劑(ji)-FITC（異(yi)硫氰(qing)酸熒(ying)光(guang)素(su)）

異(yi)硫氰(qing)酸熒(ying)光(guang)素(su)(fluorescein isothiocyanate, FITC)
純(chun)品(pin)為(wei)黃色(se)或(huo)橙黃色(se)結(jie)晶(jing)粉(fen)末(mo)，易溶於(yu)水和酒(jiu)精溶劑。有(you)兩種異構(gou)體，其中(zhong)異(yi)構體Ⅰ型在(zai)效(xiao)率、穩定(ding)性與蛋白質(zhi)結(jie)合(he)力(li)等(deng)方(fang)面都更(geng)優(you)良。FITC分子量為(wei)389.4，zui大(da)吸收(shou)光(guang)波(bo)長(chang)為(wei)490～495nm，zui大(da)發(fa)射光(guang)波(bo)長(chang)為(wei)525～530nm，呈現(xian)明(ming)亮的黃綠(lv)色熒(ying)光(guang)。FITC在(zai)冷(leng)暗(an)幹(gan)燥處(chu)可(ke)保(bao)存多年，是(shi)目前(qian)應(ying)用(yong)zui廣泛的熒(ying)光(guang)素(su)。其(qi)主(zhu)要(yao)優(you)點是人(ren)眼對(dui)黃綠(lv)色較(jiao)為(wei)敏感，通常(chang)切片(pian)標(biao)本(ben)中(zhong)的綠色熒(ying)光(guang)少(shao)於(yu)紅色。

FITC 是在(zai)熒(ying)光(guang)素(su)的基(ji)礎上(shang)通過(guo)化(hua)學(xue)反(fan)應(ying)增(zeng)加(jia)硫氰(qing)酸基(ji)團得(de)到(dao)的，硫氰(qing)酸基(ji)團可(ke)以和生物活性物質(zhi)例如蛋白質(zhi)上(shang)的伯胺基(ji)團反(fan)應(ying)形成硫脲(niao)鍵，從(cong)而(er)實(shi)現(xian)對生物活性物質(zhi)的熒(ying)光(guang)標(biao)記

  FITC相(xiang)關事項(xiang)
        分子式：C2HNO5S
    分子量：389.38
性質(zhi)：
    . 外(wai)觀(guan)：黃色(se)粉(fen)末(mo)
          2. 純度(du)：≥95% （HPLC）

 
3. 產品(pin)描述：FITC能和各(ge)種抗(kang)體蛋白結(jie)合(he)，結(jie)合(he)後的抗(kang)體不喪(sang)失(shi)與壹(yi)定(ding)抗(kang)原結(jie)合(he)的特異性，並在堿(jian)性溶液中(zhong)具有(you)強烈(lie)的黃綠(lv)色熒(ying)光(guang)。通過(guo)在(zai)熒(ying)光(guang)顯微(wei)鏡(jing)下(xia)觀(guan)察或(huo)流(liu)式細胞(bao)儀(yi)分析可(ke)對(dui)相(xiang)應(ying)抗(kang)原進(jin)行定(ding)性、定(ding)位或(huo)定(ding)量的檢測。用(yong)於(yu)醫學(xue)，農(nong)學(xue)和畜牧等方(fang)面，可對由(you)細菌(jun)病毒(du)和寄(ji)生蟲等所(suo)致(zhi)疾(ji)病進(jin)行快速(su)診斷(duan)。 
4. FITC標(biao)記抗(kang)體流(liu)程：                                              

（）將待交聯(lian)的蛋白（濃(nong)度(du)≥mg/ml）對(dui)交聯(lian)反(fan)應(ying)液(ye)透析三(san)次4℃，至(zhi)pH=9.0。交聯(lian)反(fan)應(ying)液(ye)配制方(fang)法：7.56g NaHCO3，.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定(ding)容至(zhi) L。

（2）將FITC溶於(yu)DMSO中，濃(nong)度(du)為(wei)mg/mL。每(mei)次交聯(lian)使用(yong)的FITC均應(ying)新(xin)鮮(xian)配制，避(bi)光(guang)。

（3）按(an)P:F（蛋白質(zhi):FITC）=mg:50μg 的比例將FITC緩慢加(jia)入於(yu)抗(kang)體溶液中(zhong)，邊(bian)加邊(bian)輕(qing)輕(qing)晃動使其與抗(kang)體混(hun)合(he)均(jun)勻(yun)，暗處(chu)4 ℃反(fan)應(ying)8 h。
（4）加(jia)入5mol/L的NH4Cl至(zhi)終濃(nong)度(du)50mmol/L， 4 ℃終止(zhi)反應(ying)2 h。     

（5）將(jiang)交聯(lian)物(wu)在PBS中(zhong)透析四(si)次以上，至(zhi)透析液(ye)清亮。
（6）交聯(lian)物(wu)的鑒定(ding)

　蛋白濃(nong)度(du)（mg/mL） = [ A280– 0.3×A495 ] / .4

　F/P比(bi)例: 3.×A495 / [A280 – 0.3×A495 ]，該(gai)值(zhi)應(ying)介(jie)於(yu)2.5 ~ 6.5之間。

（7）FITC交聯(lian)的蛋白應(ying)置(zhi)於(yu)pH 7.4的磷(lin)酸鹽(yan)緩沖液中，加(jia)入0.% NaN3、% BSA，4℃避光(guang)保(bao)存。 儲(chu)存條(tiao)件(jian)：4℃避光(guang)保(bao)存

FITC是(shi)壹(yi)種(zhong)常(chang)用(yong)的綠色熒(ying)光(guang)探針(zhen)。FITC的吸收(shou)(激發(fa))和發(fa)射峰參見下(xia)表。
Fluorophore       Absorption Peak(nm)         Emission Peak(nm) 
FITC                   492                        520  
當FITC在(zai)堿(jian)性溶液中(zhong)與抗(kang)體蛋白反應(ying)時(shi)，主要(yao)是蛋白質(zhi)上(shang)賴(lai)氨(an)酸的r氨基(ji)與熒(ying)光(guang)素(su)的硫碳胺(an)鍵(thiocarbmide)結(jie)合(he)，形成FITC-蛋白質(zhi)結(jie)合(he)物(wu)，即(ji)熒(ying)光(guang)抗(kang)體或(huo)熒(ying)光(guang)結(jie)合(he)物(wu)。壹(yi)個(ge)IgG分子中有86個(ge)賴(lai)氨(an)酸殘基(ji)，壹(yi)般(ban)zui多能結(jie)合(he)5～20個(ge)，壹(yi)個(ge)IgG分子可結(jie)合(he)2～8個(ge)分子的FITC，其反應(ying)式(shi)如下(xia)
FITC-N=C=S  +  N-H2-蛋白質(zhi)  →  FITC-NS-C-N-H2-蛋白質(zhi)
    常(chang)用(yong)Marsshall(958)法(fa)標(biao)記熒(ying)光(guang)抗(kang)體，也(ye)可以根(gen)據(ju)條(tiao)件采用(yong)Chadwick等(deng)標(biao)記法(fa)或(huo)Clark等(963)的透析標(biao)記法(fa)。
    ．Marsshall法
    ()材(cai)料(liao)    抗(kang)體球(qiu)蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽(yan)緩沖液、無菌(jun)生理(li)鹽(yan)水(shui)、異(yi)硫氰(qing)酸熒(ying)光(guang)
素(su)、％硫柳(liu)汞(gong)水(shui)溶液、50ml小燒杯(bei)、4℃冰(bing)箱、電(dian)磁攪拌(ban)器(qi)、透析袋(dai)、玻(bo)棒(bang)、pH7．2或(huo) 3．0的0．0mol／LPBS等。
    (2)方(fang)法及步驟(zhou)    ①抗(kang)體的準備  取適(shi)量(liang)已(yi)知濃(nong)度(du)的球(qiu)蛋白溶液於(yu)燒杯中，再加(jia)人(ren)生理(li)鹽(yan)水(shui)及(ji)碳酸鹽(yan)緩沖液，使zui後免疫(yi)球(qiu)蛋白濃(nong)度(du)為(wei)20mg／ml，碳酸鹽(yan)緩沖液容量(liang)為(wei)總(zong)量的／0，混(hun)勻(yun)，將燒瓴(ling)置電(dian)磁攪拌(ban)器(qi)上(shang)(速(su)度適(shi)當以不起泡沫為(wei)宜)5～0min。
    ②熒(ying)光(guang)素(su)的準備  根(gen)據(ju)欲(yu)標(biao)記的蛋白質(zhi)總(zong)量(liang)，按(an)每毫(hao)克免疫(yi)球(qiu)蛋白加0．0mg熒(ying)光(guang)色(se)素(su)，用(yong)分析天(tian)平(ping)準確稱取所(suo)需的異硫氰(qing)酸熒(ying)光(guang)素(su)粉(fen)末(mo)。也(ye)可用(yong)下(xia)述(shu)公式(shi)計算(suan)出免(mian)疫(yi)球(qiu)蛋白、熒(ying)光(guang)素(su)的量，還可以算(suan)出需(xu)加(jia)緩沖液的量。
    a．蛋白溶液：含量(liang)Amg／m；容(rong)積(ji)Bml。
    b．總蛋白量(AXB)＝Crag。
    c．C／20～C／0＝Dmg(如蛋白含量(liang)低(di)於(yu)20mg／ml，用(yong)C／0；如(ru)高於(yu)20mg／ml，用(yong)C／20)。
    d．熒(ying)光(guang)素(su)FITC的量：(／50～2／00)XC＝Emg。
    e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸鹽(yan)緩沖液D／0＝Fml。
    f． PBS量D-(B+F)=Gml。
    註(zhu)：A為(wei)蛋白含量(liang)，mg／ml；B為(wei)蛋白質(zhi)溶液的容積(ji)；C為(wei)蛋白總量，mg；D為(wei)常(chang)數(shu)，mg；正為(wei)熒(ying)光(guang)素(su)的量，mg；F為(wei)碳酸鹽(yan)緩沖液的容積(ji)，ml；G為(wei)PBS的容積(ji)，ml。
    ③結(jie)合(he)(或(huo)標(biao)記)  邊(bian)攪拌(ban)邊(bian)將稱取的熒(ying)光(guang)色(se)素(su)漸漸加入球(qiu)蛋白溶液中(zhong)，避(bi)免將(jiang)熒(ying)光(guang)素(su)粘(zhan)於(yu)燒瓶壁(bi)(大(da)約在(zai)5—0min內(nei)加完(wan))，加(jia)完後，繼(ji)續(xu)避光(guang)攪(jiao)拌(ban)2h左右(you)。結(jie)合(he)期(qi)間(jian)應(ying)保(bao)持(chi)蛋白溶液於(yu)4℃左右(you)，故(gu)需將燒杯(bei)和攪(jiao)拌(ban)器(qi)壹(yi)起移(yi)人(ren)4℃冰(bing)箱中(zhong)。
    ④透析  結(jie)合(he)完(wan)畢後，將標(biao)記的球(qiu)蛋白溶液離(li)心(xin)(2500r／min)20rain，除去(qu)其中少(shao)量的沈澱物(wu)，裝(zhuang)入透析袋(dai)中(zhong)，再置(zhi)於(yu)燒杯中，用(yong)pH8．0緩沖鹽(yan)水(shui)透析(0～4~C)過(guo)夜(ye)。
    ⑤過柱(zhu)  取透析過(guo)夜(ye)的標(biao)記物(wu)，通過(guo)葡(pu)聚糖(tang)凝膠SephadexG-25或(huo)G—50柱，分離遊離(li)熒(ying)光(guang)素(su)，收(shou)集標(biao)記的熒(ying)光(guang)抗(kang)體進(jin)行鑒定(ding)。洗脫(tuo)液：0．0mol／L磷(lin)酸鹽(yan)緩沖液(pH7．2)；過濾(lv)量(liang)：2ml標(biao)記蛋白液(過濾(lv)前(qian)未(wei)透析)；收(shou)集量：20ml(稀(xi)釋(shi)．7倍(bei)左右(you))。
    2．Chadwick法(fa)
    ()試(shi)劑(ji)和材(cai)料(liao)    抗(kang)體球(qiu)蛋白溶液、異(yi)硫氰(qing)酸熒(ying)光(guang)素(su)、3%碳酸鈉(na)水(shui)溶液、0．0mol/L pH8.0PBS、%硫柳(liu)汞(gong)、離(li)心(xin)機(ji)及離心(xin)管、燒(shao)杯（25ml）攪(jiao)拌(ban)器(qi)、無(wu)菌(jun)吸管(guan)，無(wu)菌(jun)吸管(guan)及(ji)毛細滴管(guan)、燒(shao)杯（500ml）透析袋(dai)等(deng)。
    (2)方(fang)法及步驟(zhou)    ①抗(kang)體準備  用(yong)o～4~C的pH8。0磷(lin)酸鹽(yan)緩沖鹽(yan)水(shui)將(jiang)球(qiu)蛋白溶液稀(xi)釋(shi)至(zhi)濃(nong)度(du)為(wei)30～40mg／ml，置(zhi)入25ml燒杯內(nei)，放於(yu)冰(bing)槽中。
    ②熒(ying)光(guang)色(se)素(su)準備  按(an)每毫(hao)克免疫(yi)球(qiu)蛋白加入熒(ying)光(guang)素(su)0．0rug計算(suan)，稱取所(suo)需的熒(ying)光(guang)素(su)，用(yong)3％碳酸鈉(na)水(shui)溶液溶解。
    ③將準備的抗(kang)體與熒(ying)光(guang)色(se)素(su)溶液等(deng)量(liang)混(hun)合(he)，充(chong)分攪勻(yun)，在o～4~C冰(bing)箱中(zhong)結(jie)合(he)(在(zai)磁力(li)攪(jiao)拌(ban)機(ji)上(shang)持(chi)續(xu)攪拌(ban))8～24h。
    ④透析和柱(zhu)層析  方(fang)法同Marsshall法。
    3．改(gai)良法
    ()試(shi)劑(ji)和材(cai)料(liao)    ①0．0mol／L(pH7．2)PBS配法(fa)中，校定(ding)pH至(zhi)7．2。NaCi 8g、Na2HP04 ．5g，溶於(yu)2000ml蒸(zheng)餾水(shui)
    ②0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽(yan)緩沖液配法(fa)  取0．5mol／LNazCOs(5．3％)0ml加(jia)入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混(hun)合(he)後，校定(ding)pH至(zhi)9．0。
    ③3％碳酸鈉(na)水(shui)溶液配(pei)法(fa)  稱L 5g充(chong)分溶解於(yu)50ml滅菌(jun)蒸(zheng)餾水(shui)中(zhong)即(ji)成。
    ④其(qi)他(ta)試(shi)劑(ji)和材(cai)料(liao)  l％*、離心(xin)機及離心管、燒(shao)杯(bei)(25m)、攪拌(ban)器(qi)、無(wu)菌(jun)吸管(guan)及(ji)毛細滴管(guan)、燒(shao)杯(500m)透析袋(dai)等(deng)。
    (2)方(fang)法及步驟(zhou)    ①取價(jia)的抗(kang)人(ren)球(qiu)蛋白兔免疫(yi)血清，分離球(qiu)蛋白，用(yong)鹽(yan)水(shui)(0．5mol／LNaCl)及(ji)緩沖液(0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀(xi)釋(shi)使每毫(hao)升內(nei)含蛋白質(zhi)lOmg，緩沖液為(wei)總(zong)量的0％，降溫至(zhi)4℃。
    ②加入異硫氰(qing)酸鹽(yan)(FITC)熒(ying)光(guang)素(su)[蛋白：熒(ying)光(guang)素(su)＝(50—80)mg‘lmg]，在(zai)0～4~C
下(xia)電(dian)磁攪拌(ban)2～4h。
    ③然後用(yong)半(ban)飽(bao)和的硫酸銨將(jiang)標(biao)記球(qiu)蛋白沈澱分離，除去(qu)未(wei)結(jie)合(he)的熒(ying)光(guang)素(su)，再用(yong)緩沖鹽(yan)水(shui)透析，除(chu)去(qu)硫酸銨(用(yong)Nessler試(shi)劑(ji)測(ce)驗(yan)，至(zhi)隔夜透析的鹽(yan)水(shui)無(wu)氨離子及(ji)熒(ying)光(guang)色(se)素(su)為(wei)止(zhi))。
    ④將制備好的熒(ying)光(guang)抗(kang)體加*o．0％，分裝在lml安瓿(bu)中(zhong)，或(huo)凍(dong)幹(gan)，保(bao)存於(yu)冰(bing)箱中(zhong)(4℃)可(ke)以用(yong)半(ban)年以上，壹(yi)20~C保(bao)存可(ke)達(da)2年以上。
    4．透析標(biao)記法(fa)

   此(ci)法適(shi)用(yong)於(yu)小量抗(kang)體的熒(ying)光(guang)素(su)標(biao)記，標(biao)記簡(jian)便(bian)，非(fei)特(te)異性染色較少(shao)。
   ()試(shi)劑(ji)和材(cai)料(liao)   試(shi)劑(ji)和材(cai)料(liao)同改(gai)良法。
   (2)方(fang)法及步驟(zhou)   ①用(yong)0．025mol／L碳酸鹽(yan)緩沖液pH9．0，將欲(yu)標(biao)記免(mian)疫(yi)球(qiu)蛋白稀(xi)釋(shi)成％濃(nong)度(du)，裝(zhuang)入透析袋(dai)中(zhong)。
   ②用(yong)同(tong)壹(yi)緩沖液將FITC配(pei)成0．mg／ml的溶液，按(an)0mg／ml球(qiu)蛋白溶液體積(ji)的0倍，將FITC稀(xi)釋(shi)液(ye)盛(sheng)於(yu)圓(yuan)柱形容器(qi)內(nei)，並使透析袋(dai)浸(jin)沒(mei)於(yu)FITC液中。
   ③容器(qi)頂(ding)端蓋緊，底(di)部(bu)放攪拌(ban)棒(bang)，在(zai)4~C電磁攪拌(ban)下(xia)透析標(biao)記24h。取出(chu)透析袋(dai)中(zhong)標(biao)記液(ye)，即(ji)刻(ke)用(yong)SephadexG50凝(ning)膠(jiao)過濾(lv)，去(qu)除遊離(li)熒(ying)光(guang)素(su)，分裝，貯(zhu)存於(yu)4℃中。