谷(gu)研(yan)試(shi)劑-人(ren)類(lei)免疫缺陷病(bing)毒(du)抗(kang)體的(de)ELISA測定(ding)

                     谷研(yan)試(shi)劑-人(ren)類(lei)免疫缺陷病(bing)毒(du)抗(kang)體的(de)ELISA測定(ding)

人(ren)類(lei)免疫缺陷病(bing)毒(du)抗(kang)體（抗(kang)-HIV）目前(qian)在(zai)臨床(chuang)和(he)血(xue)站實(shi)驗室主(zhu)要的檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)是(shi)酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、膠(jiao)體金(jin)或硒(xi)試(shi)紙(zhi)條(tiao)和(he)免疫化學發(fa)光法(fa)，zui常(chang)用的(de)是(shi)ELISA。ELISA測定現(xian)通常(chang)為(wei)采用(yong)手(shou)工操(cao)作(zuo)或全(quan)自(zi)動(dong)酶(mei)免疫分析(xi)儀(yi)的以微孔板條(tiao)為(wei)固(gu)相(xiang)的測定模式，測定(ding)操(cao)作(zuo)非常(chang)簡單(dan)，壹般(ban)涉(she)及(ji)到(dao)標本的收(shou)集保(bao)存、試(shi)劑準(zhun)備、加樣、溫育(yu)、洗板、顯(xian)色(se)、比(bi)色(se)、結果判(pan)斷和結果報告及(ji)解釋(shi)等(deng)方面，其(qi)中(zhong)任壹環(huan)節(jie)的不(bu)當(dang)都(dou)會影響(xiang)測定(ding)結果，且(qie)尤以加樣、溫育(yu)和(he)洗板等(deng)步(bu)驟為(wei)甚(shen)。現(xian)分述(shu)如下。

 壹、臨(lin)床(chuang)標本的收(shou)集和(he)保(bao)存

  用(yong)於(yu)ELISA測(ce)定(ding)的臨床(chuang)標本zui為(wei)常(chang)用的(de)是(shi)血(xue)清(qing)（漿(jiang)），有時也用到唾液(ye)、尿液(ye)等標本。影響(xiang)抗-HIV ELISA測(ce)定(ding)的(de)標本因(yin)素包(bao)括標本溶血(xue)、標本被細(xi)菌汙(wu)染、標本貯存時(shi)間(jian)過(guo)長(chang)和標本凝(ning)固(gu)不(bu)全(quan)等。
      ．標本溶血(xue) 要註意(yi)避(bi)免出現(xian)嚴(yan)重(zhong)溶(rong)血(xue)。血(xue)紅(hong)蛋(dan)白中(zhong)含有血(xue)紅(hong)素基(ji)團，其(qi)有類似過(guo)氧化(hua)物的活性(xing)，因(yin)此，在以辣根過(guo)氧化(hua)物酶（HRP）為(wei)標記酶的ELISA測(ce)定(ding)中(zhong)，如血(xue)清(qing)標本中血(xue)紅(hong)蛋(dan)白濃(nong)度(du)較(jiao)高(gao)，則(ze)其(qi)就(jiu)很(hen)容易(yi)在(zai)溫育(yu)過(guo)程(cheng)中(zhong)吸附於固(gu)相(xiang)，從而與(yu)後(hou)面加(jia)入(ru)的HRP底(di)物反(fan)應(ying)顯色(se)。
      2．標本被細(xi)菌汙(wu)染 樣本的采集(ji)及(ji)血(xue)清(qing)分離(li)中要註意(yi)盡(jin)量避(bi)免細菌汙(wu)染。壹則(ze)細(xi)菌的生(sheng)長(chang)，其所分泌的(de)壹些(xie)酶(mei)可能(neng)會(hui)對抗(kang)原(yuan)抗體等蛋(dan)白產(chan)生(sheng)分解作(zuo)用；二(er)則壹些(xie)細(xi)菌的內源性(xing)酶如大腸(chang)桿(gan)菌的β-半乳(ru)糖苷(gan)酶本身(shen)會對用(yong)相(xiang)應酶作(zuo)標記的測定(ding)方(fang)法(fa)產(chan)生(sheng)非特(te)異(yi)性(xing)幹(gan)擾。
      3．標本貯存時(shi)間(jian)過(guo)長(chang) 標本在2~8℃下(xia)保(bao)存時(shi)間(jian)過(guo)長(chang)，IgG可聚(ju)合(he)成(cheng)多(duo)聚體(ti)，在間(jian)接(jie)法(fa)ELISA測(ce)定(ding)中會導致(zhi)本底過(guo)深、甚(shen)至(zhi)造成假(jia)陽性(xing)。血(xue)清(qing)標本如是(shi)以無菌操(cao)作(zuo)分離(li)，則可(ke)以在2～8℃下(xia)保(bao)存壹周(zhou)，如為(wei)有菌操(cao)作(zuo)，則建(jian)議(yi)冰凍(dong)保(bao)存。樣本的長(chang)時間(jian)保(bao)存，應(ying)在(zai)－70℃以下。
      4．標本凝(ning)固(gu)不(bu)全(quan) 血(xue)液(ye)采集(ji)後(hou)，如收集(ji)管中(zhong)無促凝(ning)劑和(he)抗(kang)凝(ning)劑，則(ze)血(xue)液(ye)通常(chang)在半(ban)小時(shi)後(hou)開(kai)始凝(ning)固(gu)，8~24h*凝(ning)固(gu)。日常(chang)檢驗中，常(chang)在血(xue)液(ye)還未(wei)開(kai)始凝(ning)固(gu)時即離(li)心分離(li)血(xue)清(qing)，此時因(yin)血(xue)液(ye)沒有*凝(ning)固(gu)，離(li)出的(de)“血(xue)清(qing)”並(bing)非為(wei)*的(de)血(xue)清(qing)，其(qi)中仍(reng)殘(can)留部分纖維蛋(dan)白原(yuan)，如將(jiang)其(qi)加入(ru)微孔中，在(zai)ELISA測定(ding)過(guo)程(cheng)中(zhong)仍(reng)可(ke)以形成(cheng)肉眼(yan)可(ke)見的(de)纖維蛋(dan)白塊(kuai)，易(yi)造(zao)成(cheng)假(jia)陽性(xing)結果。因(yin)此，血(xue)液(ye)標本采集(ji)後(hou)，應使其充分凝(ning)固(gu)後(hou)再分離(li)血(xue)清(qing)，或標本采集(ji)時用(yong)帶分離(li)膠(jiao)的或於(yu)中(zhong)加入(ru)適(shi)當的(de)促凝(ning)劑。
      5．冰凍(dong)保(bao)存標本避(bi)免反(fan)復凍(dong)融(rong) 冰凍(dong)保(bao)存的(de)血(xue)清(qing)標本須註(zhu)意(yi)避(bi)免因(yin)停(ting)電(dian)等造(zao)成的反(fan)復凍(dong)融(rong)。標本的反(fan)復凍(dong)融(rong)所產(chan)生(sheng)的機(ji)械(xie)剪(jian)切(qie)力將(jiang)對標本中的(de)蛋(dan)白等(deng)分子產(chan)生(sheng)破壞作(zuo)用，從(cong)而引(yin)起(qi)假(jia)陰性(xing)結果。此外，凍(dong)融(rong)標本的混(hun)勻亦(yi)應註意(yi)，不(bu)要進(jin)行劇烈振蕩(dang)，反(fan)復顛倒(dao)混(hun)勻(yun)即可。此外，標本在保(bao)存中(zhong)如出現(xian)細菌汙(wu)染所致(zhi)的(de)混濁或絮(xu)狀(zhuang)物時(shi)，應離(li)心沈(chen)澱後(hou)取(qu)上清(qing)檢(jian)測。

 二(er)、試劑準(zhun)備

     在(zai)有些臨(lin)床(chuang)實(shi)驗室，對ELISA測(ce)定的試劑準(zhun)備有時比(bi)較(jiao)隨(sui)意(yi)，較(jiao)少(shao)有其可(ke)能(neng)會(hui)影響(xiang)實(shi)驗結果的意(yi)識(shi)，通常(chang)的做(zuo)法(fa)是(shi)，在實(shi)驗時將(jiang)試(shi)劑從(cong)冰箱中拿(na)出(chu)來(lai)即用，而忽(hu)略(lve)了(le)這(zhe)種(zhong)做(zuo)法(fa)有可能(neng)影響(xiang)後(hou)面溫育(yu)時(shi)間(jian)不(bu)夠(gou)的(de)問題，其直接(jie)的(de)後(hou)果是(shi)對壹些(xie)弱(ruo)陽性(xing)標本的檢(jian)測出(chu)現(xian)假(jia)陰性(xing)。因(yin)此在ELISA測(ce)定中(zhong)試劑的(de)準(zhun)備zui為(wei)關(guan)鍵的(de)是(shi)，在實(shi)驗開(kai)始前(qian)，將(jiang)試(shi)劑盒(he)先(xian)從(cong)冰箱中拿(na)出(chu)來(lai)。在室溫下(xia)放(fang)置20分鐘以上後(hou)再進(jin)行測定，以使試劑盒(he)在(zai)使用前與(yu)室溫平(ping)衡。這樣做的目(mu)的主(zhu)要是(shi)為(wei)了(le)在(zai)後(hou)面的(de)溫育(yu)反(fan)應(ying)步(bu)驟中，能(neng)使反(fan)應(ying)微孔內的(de)溫度(du)能(neng)較(jiao)快地達到所要求的(de)37℃，以滿足測(ce)定(ding)要求。所以，實(shi)驗室應(ying)有保(bao)證室溫在(zai)壹定(ding)範(fan)圍的(de)措(cuo)施(shi)和設施(shi)，如空調。並(bing)且(qie)這個(ge)範(fan)圍不(bu)宜(yi)過(guo)大，如可以定在(zai)23℃±2～3℃。其次(ci)，目(mu)前(qian)的商(shang)品ELISA試劑盒(he)中(zhong)的(de)洗板液(ye)，均需(xu)在實(shi)驗室使用時對所提(ti)供的(de)濃(nong)縮(suo)液(ye)稀釋配制，因(yin)此稀釋時所用(yong)的(de)蒸(zheng)餾水(shui)或去(qu)離(li)子水(shui)應(ying)保(bao)證質量。

 三(san)、加血(xue)清(qing)標本及(ji)反(fan)應(ying)試劑

      在(zai)現(xian)在的(de)ELISA商(shang)品試劑盒(he)中(zhong)，血(xue)清(qing)樣本的加(jia)入幾乎是(shi)*的要使用微量加樣器或全(quan)自(zi)動(dong)加(jia)樣系(xi)統(tong)加入標本的步(bu)驟。使用微量加樣器手(shou)工加(jia)樣必須註(zhu)意(yi)的(de)關(guan)鍵點是(shi)，加樣不(bu)可(ke)太快，要避(bi)免加在孔壁(bi)上部，不(bu)可(ke)濺出(chu)和(he)產(chan)生(sheng)氣泡(pao)。加(jia)樣太快，無法(fa)保(bao)證微量加樣的準(zhun)確(que)性(xing)和均(jun)壹性(xing)。加在(zai)孔(kong)壁上部的(de)非(fei)包被區(qu)，易(yi)導(dao)致(zhi)非(fei)特(te)異(yi)吸(xi)附。濺出(chu)會對鄰(lin)近孔(kong)產(chan)生(sheng)汙(wu)染，出(chu)現(xian)氣泡(pao)則(ze)反(fan)應(ying)液(ye)界(jie)面有差異(yi)。試(shi)劑的(de)加(jia)入(ru)在國(guo)產(chan)試劑盒(he)中(zhong)基(ji)本上均(jun)是(shi)從滴(di)瓶(ping)中(zhong)滴(di)加，除了(le)要註意(yi)滴(di)加的角度(du)外，滴(di)加的速(su)度(du)也很(hen)重要。滴(di)加太快，很(hen)容易(yi)出(chu)現(xian)重復滴(di)加或加(jia)在(zai)兩(liang)孔之間的(de)現(xian)象，這(zhe)樣就(jiu)會在孔(kong)內的(de)非(fei)包(bao)被區(qu)出(chu)現(xian)非特(te)異(yi)吸(xi)附，從而引(yin)起(qi)非特(te)異(yi)顯(xian)色(se)。所以，有時候(hou)壹份(fen)標本用相(xiang)同的試劑盒(he)這(zhe)次(ci)測(ce)定(ding)為(wei)陽性(xing)，下次(ci)測(ce)定(ding)為(wei)陰(yin)性(xing)，往往(wang)就(jiu)是(shi)上述(shu)加(jia)樣及(ji)試(shi)劑的(de)錯誤所致(zhi)。在(zai)使用全自(zi)動(dong)加(jia)樣系(xi)統(tong)加樣時，則必(bi)須為(wei)壹次(ci)性(xing)吸頭，反(fan)復使用的鋼針，則會因(yin)為(wei)標本之間的(de)交叉(cha)汙(wu)染，而出(chu)現(xian)假(jia)陽性(xing)結果，在常(chang)規檢(jian)測中(zhong)，表現(xian)為(wei)“拖帶”現(xian)象。

 四(si)、溫育(yu)

     溫育(yu)是(shi)ELISA測定中影響(xiang)測定(ding)成(cheng)敗(bai)zui為(wei)關(guan)鍵的(de)壹個(ge)因(yin)素。ELISA作(zuo)為(wei)壹種(zhong)固(gu)相(xiang)免疫測定，抗(kang)原(yuan)抗體的結合(he)反(fan)應(ying)在固相(xiang)上進(jin)行，要使液(ye)相(xiang)中的抗原(yuan)或抗(kang)體(ti)與(yu)固(gu)相(xiang)上的(de)特(te)異(yi)抗(kang)體(ti)或抗(kang)原(yuan)*結合(he)，必(bi)須在壹定(ding)的(de)溫度(du)條(tiao)件(jian)下(xia)反(fan)應(ying)壹定(ding)的(de)時間(jian)。溫育(yu)所需(xu)時間與(yu)溫度(du)成反(fan)比(bi)，即溫度(du)越高(gao)，則(ze)所需(xu)時間相(xiang)對較(jiao)短(duan)。zui為(wei)常(chang)用的(de)溫育(yu)溫度(du)有37℃和室溫，其(qi)次(ci)是(shi)43℃和2～8℃。
      溫育(yu)這(zhe)壹步(bu)是(shi)臨床(chuang)ELISA測(ce)定(ding)中(zhong)zui容易(yi)出(chu)現(xian)問題的步(bu)驟。通常(chang)目前(qian)國(guo)內ELISA商(shang)品試劑盒(he)的(de)反(fan)應(ying)溫育(yu)時(shi)間(jian)為(wei)37℃ 30分鐘～小(xiao)時。壹般(ban)來(lai)說抗(kang)原(yuan)抗體反(fan)應(ying)在37℃下需(xu)要～2小時(shi)才(cai)能(neng)有較(jiao)*的(de)結合(he)，低(di)於小時，可(ke)能(neng)會(hui)影響(xiang)測定(ding)下(xia)限。因(yin)此，關(guan)於溫育(yu)，在(zai)實(shi)際測定(ding)操(cao)作(zuo)中壹定(ding)要註意(yi)以下幾點：（）要保(bao)證在設定(ding)的(de)溫度(du)下有足夠(gou)的(de)反(fan)應(ying)時間：壹般(ban)來(lai)說，加(jia)完(wan)樣本和/或反(fan)應(ying)試劑後(hou)，將(jiang)微孔板從(cong)室溫拿(na)至(zhi)水浴箱或溫箱中時(shi)，孔(kong)內溫度(du)從室溫升至(zhi)37℃，需(xu)要壹定(ding)的(de)時間(jian)，尤其是(shi)在室溫比(bi)較(jiao)低(di)以及(ji)非(fei)水(shui)浴(yu)的狀態(tai)下(xia)，這段(duan)升溫時(shi)間(jian)可(ke)能(neng)還比(bi)較(jiao)長(chang)；而在(zai)臨(lin)床(chuang)實(shi)驗室中(zhong)，很(hen)少有人註(zhu)意(yi)這(zhe)個(ge)問題，通常(chang)是(shi)將(jiang)微孔板壹放(fang)入(ru)溫箱即開(kai)始計(ji)時(shi)，這(zhe)樣就(jiu)很(hen)容易(yi)造(zao)成(cheng)在(zai)實(shi)際測定(ding)中(zhong)溫育(yu)時(shi)間(jian)不(bu)夠(gou)，弱(ruo)陽性(xing)樣本測不(bu)出(chu)來(lai)的問題；因(yin)此，為(wei)保(bao)證37℃下足夠(gou)的(de)溫育(yu)時(shi)間(jian)，臨床(chuang)實(shi)驗室可(ke)自(zi)行確(que)定(ding)本實(shi)驗室不(bu)同(tong)季節(jie)（不(bu)同(tong)室溫下(xia)）微孔板從(cong)室溫拿(na)至(zhi)溫箱後(hou)需(xu)要多(duo)長(chang)時間(jian)孔內溫度(du)才能(neng)達到37℃，從(cong)而適(shi)當延長(chang)板條(tiao)在(zai)溫箱中的(de)放(fang)置時間(jian)；具(ju)體(ti)的做(zuo)法(fa)是(shi)，用壹小(xiao)溫度(du)計放置板孔(kong)反(fan)應(ying)溶液(ye)中測(ce)量觀察即可；（2）溫育(yu)溫度(du)的選擇：在(zai)有的ELISA試(shi)劑盒(he)的(de)說明(ming)書中(zhong)，指(zhi)出(chu)溫育(yu)溫度(du)可有兩(liang)種，例如，壹種(zhong)是(shi)37℃下小時，另(ling)壹種(zhong)則(ze)為(wei)43℃下(xia)45分鐘；從(cong)免疫測定的(de)抗(kang)原(yuan)抗體反(fan)應(ying)的本質來(lai)看，在(zai)較(jiao)低(di)的(de)溫度(du)下反(fan)應(ying)較(jiao)長(chang)的時(shi)間zui為(wei)*，如2～8℃下反(fan)應(ying)24小時；較(jiao)高(gao)的(de)反(fan)
應(ying)溫度(du)，由(you)於(yu)分子運(yun)動(dong)的(de)加(jia)快，反(fan)應(ying)時間縮短，這(zhe)壹點對分子含(han)量較(jiao)多(duo)的強(qiang)陽性(xing)樣本的測(ce)定沒(mei)有問題，但(dan)對分子含(han)量少的弱陽性(xing)樣本則有漏(lou)檢(jian)的可能(neng)；因(yin)此，我(wo)們建(jian)議(yi)在(zai)臨(lin)床(chuang)ELISA測(ce)定(ding)中(zhong)盡量使用較(jiao)低(di)溫育(yu)溫度(du)較(jiao)長(chang)反(fan)應(ying)時間的條(tiao)件(jian)；（3）“邊緣(yuan)效應”的(de)排(pai)除：以前在(zai)使用96孔板(ban)的ELISA測(ce)定中(zhong)，常(chang)發(fa)現(xian)有“邊緣(yuan)效應”，即外周孔顯色(se)較(jiao)中(zhong)心(xin)孔(kong)深，產(chan)生(sheng)這種(zhong)“邊緣(yuan)效應”的(de)原(yuan)因(yin)可能(neng)為(wei)96孔(kong)板外周孔與(yu)中(zhong)心孔表面或熱力學(xue)特(te)征的(de)不(bu)同(tong)，但(dan)有研(yan)究(jiu)證實(shi)在溫育(yu)中(zhong)的(de)熱力學(xue)梯度(du)可能(neng)是(shi)根本原(yuan)因(yin)之所在(zai)。聚(ju)苯(ben)乙烯本身(shen)為(wei)不(bu)良(liang)熱導(dao)體(ti)，在(zai)實(shi)驗室的(de)常(chang)規ELISA測(ce)定中(zhong)，將(jiang)板(ban)從室溫（通常(chang)在25℃左右）置於37℃溫箱，板孔(kong)升溫時(shi)，在(zai)外周孔與(yu)中(zhong)心孔之間可(ke)能(neng)存在(zai)壹熱力學(xue)梯度(du)。因(yin)此使用水浴(yu)或在(zai)將(jiang)反(fan)應(ying)溶液(ye)加入(ru)至(zhi)板孔中時，將(jiang)板(ban)和溶(rong)液(ye)均加(jia)熱至(zhi)溫育(yu)溫度(du)（如37℃），就(jiu)可以很(hen)容易(yi)地(di)排(pai)除“邊緣(yuan)效應”，並(bing)且(qie)可提(ti)高(gao)測(ce)定(ding)的重(zhong)復性(xing)。
      總而言(yan)之，在臨(lin)床(chuang)ELISA測(ce)定(ding)中(zhong)，要保(bao)證好的(de)測(ce)定(ding)效果，可采用(yong)下述(shu)簡單(dan)辦(ban)法(fa)來(lai)確(que)保(bao)溫育(yu)條(tiao)件(jian)，即盡量采用(yong)水浴(yu)，溫育(yu)中(zhong)讓(rang)微孔板浮於水(shui)面上，或將(jiang)浸(jin)透(tou)水的沙布放入(ru)壹大(da)飯(fan)盒(he)中(zhong)成(cheng)壹濕(shi)盒(he)，放於(yu)溫箱中，這(zhe)樣就(jiu)會因(yin)為(wei)板(ban)條(tiao)孔(kong)底(di)部直(zhi)接(jie)與(yu)37℃水(shui)或濕(shi)布的接(jie)觸，以及(ji)水(shui)浴(yu)箱或濕(shi)盒(he)內的(de)高(gao)溫度(du)，而使反(fan)應(ying)溶液(ye)的溫度(du)迅速(su)與(yu)溫室平(ping)衡。此外，采用(yong)微波(bo)或溫育(yu)時(shi)振蕩(dang)微孔板可(ke)提(ti)高(gao)溫育(yu)效率或縮(suo)短(duan)溫育(yu)時(shi)間(jian)。

 五、洗板
   固(gu)相(xiang)免疫測定技(ji)術是(shi)壹種(zhong)非(fei)均相(xiang)免疫測定技(ji)術，需(xu)以洗滌操(cao)作(zuo)將(jiang)特(te)異(yi)結合(he)於(yu)固相(xiang)的抗原(yuan)或抗(kang)體(ti)與(yu)反(fan)應(ying)溫育(yu)過(guo)程(cheng)中(zhong)吸附的非(fei)特(te)異(yi)成(cheng)份(fen)分離(li)開(kai)來(lai)，以保(bao)證ELISA測定(ding)的(de)特(te)異(yi)性(xing)。因(yin)此，洗板對於(yu)ELISA測定來(lai)說，也是(shi)極其關(guan)鍵的(de)壹步(bu)。以HRP作(zuo)為(wei)標記酶的ELISA試(shi)劑盒(he)中(zhong)使用的洗板液(ye)壹般(ban)為(wei)含(han)0.05% Tween20的中性(xing)PBS。Tween20為(wei)壹種(zhong)非(fei)離(li)子去(qu)垢(gou)劑，既(ji)含(han)親(qin)水基(ji)團，也含疏水(shui)基團，其(qi)在洗滌中(zhong)的(de)作(zuo)用機(ji)理(li)是(shi)，借(jie)助其疏(shu)水基(ji)團(tuan)與(yu)經(jing)疏水性(xing)相(xiang)互(hu)作(zuo)用被動(dong)吸(xi)附於聚(ju)苯(ben)乙烯固相(xiang)上蛋(dan)白的(de)疏水基(ji)團(tuan)形(xing)成疏水鍵(jian)，從而削(xue)弱(ruo)蛋(dan)白與(yu)固(gu)相(xiang)的吸附，同時(shi)在其(qi)親水基(ji)團(tuan)與(yu)液(ye)相(xiang)中水分子的(de)結合(he)作(zuo)用下(xia)，促使蛋(dan)白質脫(tuo)離(li)固相(xiang)而進(jin)入(ru)液(ye)相(xiang)，這樣就(jiu)可達到去(qu)掉非特(te)異(yi)吸(xi)附物的(de)目的(de)，但(dan)由(you)於(yu)抗體或抗(kang)原(yuan)的包被通常(chang)也是(shi)通過(guo)在堿(jian)性(xing)條(tiao)件(jian)下(xia)與(yu)固(gu)相(xiang)的疏水性(xing)相(xiang)互(hu)作(zuo)用而被動(dong)吸(xi)附於固(gu)相(xiang)，因(yin)此要註意(yi)非(fei)離(li)子去(qu)垢(gou)劑的(de)使用濃(nong)度(du)。洗板液(ye)中Tween20濃(nong)度(du)高(gao)於(yu)0.2%，可(ke)使包被於(yu)固(gu)相(xiang)上的(de)抗原(yuan)或抗(kang)體(ti)解吸(xi)附而影響(xiang)試驗的測(ce)定(ding)下限。在臨(lin)床(chuang)實(shi)驗室中(zhong)，ELISA測定的(de)洗板壹般(ban)有兩(liang)種方式，即手(shou)工和(he)洗板機(ji)洗板。手(shou)工洗板即是(shi)在每次(ci)反(fan)應(ying)溫育(yu)後(hou)，將(jiang)反(fan)應(ying)液(ye)吸出(chu)或甩幹(gan)，然後(hou)在板(ban)孔中加(jia)滿洗液(ye)，放置2～3分鐘後(hou)，將(jiang)洗液(ye)吸出(chu)或甩幹(gan)，再在(zai)吸水(shui)紙(zhi)上拍幹(gan)。重復上述(shu)洗滌步(bu)驟3～4次(ci)，zui後(hou)在吸(xi)水紙(zhi)上拍幹(gan)，即可進(jin)行下壹步(bu)測(ce)定操(cao)作(zuo)。洗板機(ji)洗板則(ze)是(shi)將(jiang)上述(shu)手(shou)工操(cao)作(zuo)改(gai)由(you)洗板機(ji)進(jin)行，使用洗板機(ji)洗板的(de)壹個(ge)特(te)點是(shi)，每次(ci)洗板後(hou)不(bu)能(neng)拍幹(gan)，故有較(jiao)多(duo)的液(ye)體殘(can)留，液(ye)體殘(can)留量小的洗板機(ji)洗板至(zhi)*所需(xu)的次(ci)數(shu)要少於(yu)殘(can)留(liu)量大的洗板機(ji)。
      此外，在采用(yong)洗板機(ji)洗板時(shi)，洗板機(ji)的(de)日(ri)常(chang)清(qing)潔(jie)維護(hu)、及(ji)時(shi)更換(huan)洗液(ye)和清(qing)潔(jie)洗液(ye)瓶(ping)，對於(yu)保(bao)證洗板質量，避(bi)免“花板”非常(chang)重要。洗板機(ji)每(mei)次(ci)使用後(hou)，如不(bu)及(ji)時(shi)用(yong)蒸(zheng)餾水(shui)*沖(chong)洗管道，則(ze)可能(neng)因(yin)為(wei)洗液(ye)中磷(lin)酸鹽(yan)緩(huan)沖液(ye)的殘(can)留，壹是(shi)導致管道堵(du)塞，二(er)是(shi)會利於細(xi)菌繁(fan)殖，導致假(jia)陽性(xing)結果。洗液(ye)更換(huan)不(bu)及(ji)時(shi)和(he)洗液(ye)瓶(ping)清(qing)潔(jie)不(bu)到(dao)位，同(tong)樣會致洗液(ye)的細(xi)菌汙(wu)染。

六、顯色(se)

      在(zai)目(mu)前(qian)的(de)以HRP作(zuo)為(wei)標記酶的商(shang)品抗-HIV/2 ELISA試(shi)劑盒(he)中(zhong)，均(jun)以四甲(jia)基聯苯(ben)胺（TMB）為(wei)底(di)物，國(guo)產(chan)試劑提(ti)供的(de)底物(wu)為(wei)A和(he)B兩(liang)瓶(ping)應(ying)用液(ye)；某些(xie)進(jin)口(kou)試劑有可能(neng)為(wei)壹瓶(ping)。壹般(ban)商(shang)品試劑盒(he)顯(xian)色(se)反(fan)應(ying)條(tiao)件(jian)為(wei)37℃或室溫反(fan)應(ying)5～30分鐘。從(cong)理論(lun)上說，37℃30分鐘才(cai)可以使HRP的底物(wu)催化反(fan)應(ying)*，盡管在(zai)zui初(chu)的(de)0分鐘內，絕(jue)大(da)部份(fen)催化反(fan)應(ying)即可完成。因(yin)此，為(wei)使弱陽性(xing)樣本孔能(neng)有充分的顯(xian)色(se)，建(jian)議(yi)在(zai)37℃下(xia)反(fan)應(ying)25～30分鐘後(hou)，終止反(fan)應(ying)比(bi)色(se)測定(ding)。
      此外，在加入底(di)物(wu)開(kai)始顯(xian)色(se)反(fan)應(ying)前，是(shi)先檢查(zha)壹下(xia)底(di)物溶(rong)液(ye)的有效性(xing)，即可將(jiang)A和(he)B兩(liang)種液(ye)各加(jia)壹滴(di)於清(qing)潔(jie)的空板孔或eppendorf管中(zhong)，觀(guan)察是(shi)否有顯色(se)出現(xian)，如有，則說明(ming)底(di)物(wu)已(yi)變(bian)質。以TMB為(wei)底(di)物，整個(ge)顯色(se)反(fan)應(ying)過(guo)程(cheng)無需(xu)避(bi)光。顯色(se)反(fan)應(ying)完成後(hou)，加入(ru)酸終止反(fan)應(ying)，振蕩(dang)混(hun)勻後(hou)即可進(jin)行下面的(de)比(bi)色(se)測定(ding)或肉眼(yan)判(pan)斷結果。

七(qi)、比(bi)色(se)

    ELISA的(de)比(bi)色(se)測定(ding)由(you)酶(mei)標儀(yi)進(jin)行。有的同(tong)行可能(neng)會(hui)認(ren)為(wei)，既(ji)然由(you)酶(mei)標儀(yi)進(jin)行，那麽此時便(bian)可以萬事(shi)大吉了(le)。其(qi)實(shi)不(bu)然，因(yin)為(wei)當(dang)代較(jiao)為(wei)先(xian)進(jin)的(de)酶標儀(yi)，均有較(jiao)多(duo)的功能(neng)，使用不(bu)當(dang)，會得到令人(ren)難(nan)以理解的(de)結果。如使用酶標儀(yi)比(bi)色(se)測定(ding)後(hou)，有許多(duo)的陰(yin)性(xing)測定(ding)孔(kong)的吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)為(wei)負(fu)數(shu)或測(ce)定(ding)假(jia)陽性(xing)率大(da)大(da)增(zeng)加(jia)等等。這(zhe)主(zhu)要是(shi)沒有正確(que)地(di)理解和(he)使用酶標儀(yi)所致(zhi)。中(zhong)檔以上的(de)酶標儀(yi)基本上都(dou)同時具(ju)有單(dan)波(bo)長(chang)和雙波(bo)長(chang)比(bi)色(se)功能(neng)。所謂(wei)的(de)單(dan)波(bo)長(chang)比(bi)色(se)即是(shi)通常(chang)的以對顯(xian)色(se)具(ju)有zui大吸(xi)收(shou)的波(bo)長(chang)如450nm進(jin)行比(bi)色(se)測定(ding)；而雙波(bo)長(chang)雙色(se)則酶(mei)標儀(yi)在敏(min)感(gan)波(bo)長(chang)如450nm和非(fei)敏(min)感(gan)波(bo)長(chang)如630nm下各(ge)測(ce)定(ding)壹次(ci)，敏(min)感(gan)波(bo)長(chang)下的(de)吸光(guang)度(du)測定值(zhi)為(wei)樣本測定(ding)酶反(fan)應(ying)特(te)異(yi)顯(xian)色(se)的吸(xi)光度(du)與(yu)板(ban)孔上指(zhi)紋、刮(gua)痕(hen)、灰(hui)塵等(deng)臟(zang)物所致(zhi)的(de)吸光(guang)度(du)之和；非(fei)敏(min)感(gan)波(bo)長(chang)下測(ce)定即改(gai)變(bian)波(bo)長(chang)至(zhi)壹定(ding)值(zhi)，使得樣本測定(ding)酶反(fan)應(ying)特(te)異(yi)顯(xian)色(se)的吸(xi)光度(du)值(zhi)為(wei)零(ling)，此時測(ce)得的吸光(guang)度(du)即為(wei)臟(zang)物的吸光(guang)度(du)值(zhi)。zui後(hou)酶標儀(yi)給出(chu)的(de)數(shu)值(zhi)為(wei)敏(min)感(gan)波(bo)長(chang)下的(de)吸光(guang)度(du)值(zhi)與(yu)非(fei)敏(min)感(gan)波(bo)長(chang)下的(de)吸光(guang)度(du)值(zhi)的(de)差。因(yin)此，雙波(bo)長(chang)比(bi)色(se)測定(ding)具(ju)有能(neng)排(pai)除由(you)微孔板本身(shen)、板孔(kong)內標本的非(fei)特(te)異(yi)吸(xi)收(shou)、指紋、刮(gua)痕、灰(hui)塵等(deng)對特(te)異(yi)顯(xian)色(se)測定(ding)吸光(guang)度(du)的影響(xiang)的優(you)點，壹般(ban)不(bu)必(bi)設空白孔(kong)（除非空白本身(shen)會產(chan)生(sheng)顏色(se)）。如在使用雙波(bo)長(chang)比(bi)色(se)時，仍(reng)設空白孔(kong)，就(jiu)可能(neng)會(hui)造(zao)成(cheng)前面提(ti)到的(de)測定(ding)孔吸(xi)光(guang)度(du)為(wei)負(fu)數(shu)的現(xian)象。由(you)於(yu)ELISA測定中單(dan)個(ge)空白孔(kong)的非特(te)異(yi)吸(xi)收(shou)具(ju)有壹定(ding)程(cheng)度(du)的不(bu)確(que)定(ding)性(xing)，也就(jiu)是(shi)說每(mei)次(ci)測(ce)定(ding)或同(tong)次(ci)測(ce)定(ding)空白孔(kong)位置的不(bu)同(tong)均有可能(neng)得到不(bu)同(tong)吸光(guang)度(du)測定值(zhi)，故(gu)而在(zai)ELISA測(ce)定比(bi)色(se)時，是(shi)使用雙波(bo)長(chang)比(bi)色(se)。

八(ba)、結果判(pan)定(ding)
  臨(lin)床(chuang)ELISA測(ce)定(ding)按其表示測定(ding)結果的方(fang)式分為(wei)定(ding)性(xing)和定(ding)量測定兩(liang)大類。定性(xing)測定(ding)只(zhi)是(shi)對標本中是(shi)否含有待(dai)測抗(kang)原(yuan)或抗(kang)體(ti)作(zuo)出“有”或“無”的(de)結論(lun)，分別用(yong)“反(fan)應(ying)性(xing)”（reactive）或“陽性(xing)反(fan)應(ying)”和“非反(fan)應(ying)性(xing)”（nonreactive）或“陰(yin)性(xing)反(fan)應(ying)”來(lai)表示(shi)。抗-HIV/2 ELISA檢測為(wei)定(ding)性(xing)測定(ding)，檢(jian)測的(de)目(mu)的(de)是(shi)判(pan)斷特(te)定HIV感(gan)染(ran)的(de)存在(zai)與(yu)否(fou)。ELISA定性(xing)測定(ding)的(de)“反(fan)應(ying)性(xing)”（reactive）或“陽性(xing)反(fan)應(ying)”和“非反(fan)應(ying)性(xing)”（nonreactive）或“陰(yin)性(xing)反(fan)應(ying)”的判(pan)定(ding)依(yi)據(ju)是(shi)試劑盒(he)所確(que)定(ding)的陽性(xing)判(pan)
定(ding)值(zhi)（Cut-off）。
     下(xia)面再(zai)解釋(shi)壹下(xia)在(zai)ELISA定性(xing)測定(ding)結果判(pan)定(ding)中(zhong)常(chang)用的(de)壹些(xie)縮(suo)寫(xie)。（）S/CO：其中(zhong)S為(wei)Sample（樣本）或Specimen（標本）的簡寫(xie)，表示(shi)的是(shi)標本測定(ding)的吸(xi)光度(du)值(zhi)，CO為(wei)Cut-off值(zhi)的(de)簡寫(xie)。除競爭(zheng)抑制法(fa)外，其它ELISA定性(xing)測定(ding)模(mo)式中(zhong)，當(dang)S/CO值(zhi)大(da)於或等(deng)於(yu)時，標本的測(ce)定為(wei)“陽性(xing)反(fan)應(ying)”，小於時為(wei)“陰(yin)性(xing)反(fan)應(ying)”。（2）S/N或P/N：其(qi)中(zhong)S同（），N為(wei)Negative（陰(yin)性(xing)對照(zhao)）的簡寫(xie)，P為(wei)Patient（患(huan)者）的簡寫(xie)。較(jiao)早(zao)的(de)試劑盒(he)很(hen)多(duo)都(dou)使用S/N或P/N≥2.為(wei)陽性(xing)判(pan)定(ding)標準(zhun)，現(xian)仍(reng)有壹些(xie)試(shi)劑盒(he)使用這種(zhong)方式(shi)。這種(zhong)方式與(yu)S/CO方(fang)式無根本性(xing)區別(bie)，只(zhi)不(bu)過(guo)是(shi)前者將(jiang)陰(yin)性(xing)對照(zhao)（N）的2.倍視為(wei)Cut-off值(zhi)而已(yi)。

九、結果報告及(ji)解釋(shi)

      抗(kang)-HIV/2 ELISA測(ce)定(ding)結果的報(bao)告較(jiao)為(wei)簡單(dan)，報告“反(fan)應(ying)性(xing)”（reactive）或“陽性(xing)反(fan)應(ying)”和“非反(fan)應(ying)性(xing)”（nonreactive）或“陰(yin)性(xing)反(fan)應(ying)”即可。結果的解釋(shi)比(bi)較(jiao)起(qi)來(lai)要復雜的(de)多(duo)，它要求實(shi)驗室技(ji)術人員對所測(ce)定(ding)的項目(mu)有較(jiao)為(wei)全(quan)面的(de)知(zhi)識基(ji)礎。抗-HIV /2 ELISA檢(jian)測屬於初(chu)篩(shai)檢測(ce)，由(you)於(yu)我(wo)國(guo)人(ren)群流行率低，加上實(shi)際檢測(ce)操(cao)作(zuo)中的(de)壹些(xie)問題，抗-HIV/2檢測(ce)的(de)陽性(xing)預示(shi)值(zhi)可(ke)能(neng)較(jiao)低(di)，尤(you)其(qi)是(shi)弱陽性(xing)反(fan)應(ying)的標本。此外，在特(te)定疾(ji)病(bing)情(qing)況(kuang)下(xia)，如自(zi)身(shen)免疫病亦會(hui)出(chu)現(xian)較(jiao)多(duo)的假(jia)陽性(xing)。因(yin)此，ELISA檢測(ce)呈陽性(xing)反(fan)應(ying)的標本必須(xu)進(jin)壹步(bu)用(yong)蛋(dan)白印跡(ji)或核(he)酸(suan)檢(jian)測(ce)進(jin)行確(que)認(ren)。此外，陰性(xing)反(fan)應(ying)也不(bu)能(neng)*排(pai)除HIV感(gan)染(ran)的(de)存在(zai)。現(xian)在，檢(jian)驗不(bu)再(zai)是(shi)單(dan)純的實(shi)驗室測(ce)定，而已(yi)成為(wei)壹門臨床(chuang)醫(yi)學學(xue)科，即檢驗醫(yi)學，這(zhe)就(jiu)要求從(cong)事(shi)醫(yi)學檢(jian)驗工作(zuo)的檢(jian)驗醫(yi)師，對所做(zuo)的(de)測定(ding)項目(mu)除了(le)知(zhi)其(qi)然，還要知其(qi)所以然，否(fou)則就(jiu)難(nan)免為(wei)時(shi)代所淘(tao)汰(tai)。
      綜上所述(shu)，盡(jin)管ELISA測(ce)定(ding)的操(cao)作(zuo)步(bu)驟非常(chang)簡單(dan)，但(dan)有可能(neng)會(hui)影響(xiang)測定(ding)結果的因(yin)素卻(que)較(jiao)多(duo)，分布在測(ce)定操(cao)作(zuo)的各(ge)步(bu)之中，尤(you)以加樣、溫育(yu)和(he)洗板為(wei)甚(shen)。為(wei)幫(bang)助大家分析(xi)查(zha)找測(ce)定中(zhong)出現(xian)問題的可能(neng)原(yuan)因(yin)