谷研試劑(ji)-活(huo)化(hua)微(wei)珠的(de)交連

                            谷(gu)研試劑(ji)-活(huo)化(hua)微(wei)珠的(de)交連

           elisa試劑(ji)盒(he)抗(kang)體與固(gu)相(xiang)基質共(gong)價(jia)結合的另(ling)壹(yi)種(zhong)常用(yong)方法是(shi)利用(yong)多種(zhong)化(hua)學(xue)試劑(ji)使微(wei)珠活(huo)化(hua)，然(ran)後(hou)將(jiang)純(chun)化(hua)的抗(kang)體與活(huo)化(hua)的微(wei)珠結(jie)合。這種方法有許(xu)多優點，通(tong)常可(ke)以在超越(yue)蛋(dan)白質能夠耐受(shou)的(de)苛(ke)刻條件(jian)下使微(wei)珠活(huo)化(hua)，因(yin)此(ci)可(ke)以采(cai)用(yong)很多激(ji)活方法。此(ci)外，許(xu)多結(jie)合方法形(xing)成的交連，在範圍(wei)廣(guang)泛(fan)的變(bian)性條(tiao)件(jian)下仍(reng)保(bao)持穩(wen)定。另(ling)壹(yi)個優點是(shi)許(xu)多活(huo)性(xing)微(wei)珠有商(shang)品出售。總的(de)說(shuo)來，商(shang)品化(hua)的微(wei)珠為(wei)免(mian)疫(yi)親(qin)和純(chun)化(hua)提供(gong)了(le)較好的(de)活(huo)化(hua)微(wei)珠。

    ．準(zhun)備工作

    應用(yong)抗(kang)體柱(zhu)對(dui)各種(zhong)進(jin)行(xing)親(qin)和純(chun)化(hua)的主(zhu)要(yao)特(te)點是(shi)在足夠(gou)溫和的(de)條(tiao)件(jian)下就(jiu)能(neng)將抗(kang)原從層析(xi)柱(zhu)上(shang)洗(xi)脫，並(bing)能(neng)保(bao)持(chi)蛋(dan)白質的結構和／或(huo)功能不改(gai)變(bian)。洗(xi)脫的(de)難(nan)易是(shi)由連(lian)接(jie)抗(kang)原與抗(kang)體之(zhi)間結合鍵(jian)的類(lei)型(xing)和數量決(jue)定(ding)的(de)。在制備大(da)規模層(ceng)析(xi)柱(zhu)用(yong)於純(chun)化(hua)之前(qian)，有必(bi)要對(dui)所有可(ke)利用(yong)的抗(kang)體進(jin)行(xing)測試(shi)，從中(zhong)選擇(ze)適當的抗(kang)體制備親(qin)和層(ceng)析(xi)柱(zhu)。

    所制備的(de)抗(kang)體緩沖(chong)液(ye)中(zhong)不應含有無(wu)關的(de)化(hua)合物，因(yin)其可(ke)通(tong)過(guo)反應基團(tuan)結合到(dao)活(huo)性(xing)微(wei)珠上(shang)，這種結(jie)合反應很可(ke)能就(jiu)發(fa)生在抗(kang)體的(de)氨基(或(huo)巰(qiu)基)上(shang)。如(ru)果(guo)這些(xie)化(hua)合物是(shi)在抗(kang)體純(chun)化(hua)時使用(yong)，所制備的(de)抗(kang)體必(bi)須對(dui)0．5mol／LPBS(pH7，5)結(jie)合緩沖(chong)液(ye)充(chong)分透(tou)析(xi)。

    2．所需(xu)溶(rong)液(ye)、試(shi)劑(ji)和特(te)殊(shu)設(she)備(bei)

    純(chun)化(hua)的抗(kang)體；    0．5mmol／L磷酸(suan)鈉(pH7．5)；    含mol／LNaCi的(de)0．05mol／L磷酸(suan)鈉溶(rong)液(ye)(pH7．5)；    00mmol／L乙(yi)醇(chun)胺(pH7．5)    搖(yao)床(chuang)。

             elisa試劑(ji)盒(he) 3．操作(zuo)步(bu)驟(zhou)

    ()用(yong)0．5mol／L(pH7．5)的磷酸(suan)鈉溶(rong)液(ye)將(jiang)抗(kang)體配成所需(xu)濃(nong)度(du)。留少(shao)量(liang)樣(yang)品供(gong)測定(ding)結(jie)合效(xiao)率(lv)用(yong)。每(mei)次(ci)實驗用(yong)於結(jie)合的抗(kang)體的(de)量(liang)都不相(xiang)同(tong)。在大(da)多數實驗中每(mei)毫升(sheng)微(wei)珠內(nei)加0mg抗(kang)體可(ke)得(de)到(dao)較高(gao)容量層析(xi)柱(zhu)。

    (2)加入按(an)產品使用(yong)說(shuo)明(ming)制備的(de)活(huo)化(hua)的微(wei)珠

    (3)置(zhi)搖(yao)床(chuang)上(shang)輕(qing)輕(qing)混合放(fang)室溫過(guo)夜(ye)。

    (4)用(yong)0．5mol／L磷酸(suan)鈉(pH7．5)洗(xi)滌微(wei)珠2次(ci)。留取(qu)結合過(guo)夜(ye)的上(shang)清(qing)，  比(bi)較結合前、後(hou)樣(yang)本(ben)中(zhong)的(de)蛋(dan)白含量(liang)。

    (5)用(yong)含mol／LNaCl的(de)0．05mol／L磷酸(suan)鈉溶(rong)液(ye)(PBS，pH7．5)洗(xi)滌微(wei)珠次(ci)。

    (6)加0倍體積的(de)00retool／L乙(yi)醇胺(pH7．5)室溫下孵育(yu)4h或(huo)過(guo)夜(ye)，振(zhen)蕩。

    (7)用(yong)PBS洗(xi)滌2次(ci)，加入0．0％硫(liu)柳(liu)，免疫(yi)微(wei)珠可(ke)置(zhi)4C貯(zhu)存(cun)，數月內(nei)保持穩定。

    制備好的(de)微(wei)珠即呵用(yong)於抗(kang)原的免疫(yi)親(qin)和純(chun)化(hua)

    常見(jian)問(wen)題

    將(jiang)抗(kang)體有效(xiao)地(di)結(jie)合到(dao)活(huo)性(xing)微(wei)珠上(shang)雖是(shi)——項(xiang)簡(jian)單的(de)工作，但(dan)保(bao)持抗(kang)體的(de)活(huo)性常很(hen)困難(nan)。抗(kang)體失(shi)活(huo)大(da)多是(shi)由於(yu)抗(kang)體與微(wei)珠過(guo)度偶(ou)聯(lian)，或(huo)偶(ou)聯(lian)發(fa)生在抗(kang)體的(de)抗(kang)原識(shi)別區。這兩(liang)種結果(guo)都會使抗(kang)體—微(wei)珠基質結(jie)合抗(kang)原的能力顯著(zhu)低於(yu)未(wei)偶(ou)聯(lian)的同(tong)量抗(kang)體。保(bao)持(chi)0％-50％的結(jie)合活性(xing)較為(wei)常見(jian)，並(bing)可(ke)認為(wei)是(shi)活(huo)性(xing)良(liang)好水平。在偶(ou)聯(lian)過(guo)程(cheng)中(zhong)，如(ru)果(guo)抗(kang)體的(de)活(huo)性遠(yuan)遠(yuan)低於這壹(yi)水平，可(ke)采取(qu)下(xia)列(lie)三種(zhong)措施保(bao)持(chi)抗(kang)體活(huo)性(xing)。

    *種控制失活(huo)的(de)重(zhong)要方法是(shi)在廣(guang)泛(fan)偶(ou)聯(lian)之前(qian)終止(zhi)反應，偶(ou)聯(lian)率(lv)可(ke)以在開始實驗前測定(ding)。當(dang)不到(dao)50％的(de)抗(kang)體結(jie)合時即停(ting)止(zhi)反應，未(wei)結(jie)合的抗(kang)體不會受(shou)到(dao)損害，可(ke)以在其他(ta)實驗中再使用(yong)，及早(zao)終(zhong)止(zhi)反應可(ke)以控制每(mei)種抗(kang)體通(tong)過(guo)許(xu)多不同(tong)位點(dian)偶(ou)聯(lian)。終止(zhi)結(jie)合反應的恰當時(shi)間可(ke)通(tong)過(guo)壹(yi)個小規模的(de)不同(tong)作(zuo)用(yong)時間來確(que)定(ding)。未(wei)偶(ou)聯(lian)的抗(kang)體可(ke)通(tong)過(guo)SDS隅聚(ju)丙(bing)烯酰胺凝膠電(dian)泳，和考(kao)馬(ma)斯亮(liang)藍(lan)染(ran)色來測(ce)定(ding)重(zhong)鏈和輕(qing)鏈條帶。

    第(di)二(er)種(zhong)防(fang)止(zhi)過(guo)度偶(ou)聯(lian)的方法是(shi)調(tiao)整(zheng)反應的pH值(zhi)以(yi)減(jian)慢偶(ou)聯(lian)速度。大(da)多數偶(ou)聯(lian)方法是(shi)通(tong)過(guo)抗(kang)體上(shang)的(de)氨基連接(jie)，而(er)氨基基團(tuan)的反應對(dui)pH值(zhi)較敏感(gan)。如(ru)果(guo)抗(kang)體偶(ou)聯(lian)的pH值(zhi)低(di)於(yu)氨基基團(tuan)的pK值(zhi)，大(da)多數氨基基團(tuan)在任(ren)何時(shi)候(hou)都不會發(fa)生偶(ou)聯(lian)，這樣就(jiu)控制了(le)過(guo)度偶(ou)聯(lian)率(lv)。下(xia)述方法采(cai)用(yong)中性(xing)的(de)pH值(zhi)，有助(zhu)於這壹(yi)問(wen)題的(de)解(jie)決(jue)。如(ru)果(guo)仍(reng)然(ran)出現(xian)過(guo)度偶(ou)聯(lian)，可(ke)以試(shi)用(yong)略(lve)低的(de)pH值(zhi)。選(xuan)用(yong)合適的pH值(zhi)需(xu)憑經驗通(tong)過(guo)多次(ci)試驗才能確(que)定(ding)，不同(tong)的(de)抗(kang)體所需(xu)的(de)條件(jian)也不壹(yi)樣(yang)。可(ke)以采(cai)用(yong)逐漸(jian)降低(di)pH值(zhi)單(dan)位(如(ru)0．5)的方式(shi)來測(ce)試(shi)新的(de)實驗條件(jian)。另壹(yi)方面(mian)，如(ru)果(guo)出(chu)現(xian)太(tai)低(di)的偶(ou)聯(lian)率(lv)，可(ke)以增(zeng)加(jia)緩沖(chong)液(ye)的(de)pH值(zhi)，延(yan)長偶(ou)聯(lian)時間。pH值(zhi)在8．2以上(shang)時(shi)，可(ke)用(yong)0．5mol／L碳(tan)酸(suan)鹽(yan)緩沖(chong)液(ye)代(dai)替(ti)磷酸(suan)鹽(yan)緩沖(chong)液(ye)。

    第(di)三種(zhong)減(jian)少(shao)過(guo)度偶(ou)聯(lian)問(wen)題的(de)方法是(shi)將(jiang)其他(ta)氨基基團(tuan)引(yin)入抗(kang)體偶(ou)聯(lian)反應。在預備(bei)試驗時，用(yong)不同(tong)濃(nong)度(du)的帶有壹(yi)級(ji)氨基基團(tuan)的小(xiao)分子物(wu)質阻斷(duan)抗(kang)體結(jie)合到(dao)微(wei)珠上(shang)。2種(zhong)zui常用(yong)的化(hua)合物是(shi)乙(yi)醇(chun)胺和。從(cong)中(zhong)選(xuan)壹(yi)個適當濃(nong)度(du)的封(feng)閉劑(ji)使偶(ou)聯(lian)過(guo)程(cheng)中(zhong)只有約(yue)0％的抗(kang)體結(jie)合。選擇(ze)壹(yi)個合理(li)的起(qi)始濃(nong)度(du)，建議抗(kang)體的(de)zui終(zhong)濃(nong)度(du)不超過(guo)0mg／m濕微(wei)珠。

    zui後(hou)，所用(yong)的抗(kang)體可(ke)能有壹(yi)個氨基基團(tuan)是(shi)分布在抗(kang)原結合位點(dian)內(nei)。這個位點(dian)與大(da)多數活性(xing)微(wei)珠結(jie)合後(hou)特(te)別(bie)容易失活(huo)。如(ru)果(guo)在偶(ou)聯(lian)反應中，抗(kang)原結合能力(li)不斷(duan)喪(sang)失(shi)，可(ke)改用(yong)蛋(dan)白A或(huo)蛋(dan)白G微(wei)珠，以(yi)及使用(yong)不依(yi)賴(lai)於(yu)氨基基團(tuan)的雙(shuang)功能交(jiao)聯(lian)劑(ji)進(jin)行(xing)偶(ou)聯(lian)。