谷研試(shi)劑(ji)-細胞受(shou)體結合(he)免疫(yi)測(ce)定(ding)CIC法(fa)

                           谷研試(shi)劑(ji)-細胞受(shou)體結合(he)免疫(yi)測(ce)定(ding)CIC法(fa)

  細(xi)胞受(shou)體結合(he)免疫(yi)測(ce)定(ding)法(fa)是(shi)根(gen)據CIC可與(yu)某(mou)些(xie)細胞表(biao)面(mian)的(de)Fc受(shou)體或(huo)補體受(shou)體結合(he)而建(jian)立(li)的(de)細胞技(ji)術，這(zhe)類(lei)方法(fa)有(you)靈(ling)敏(min)度(du)較高，特(te)異(yi)性(xing)較強等優(you)點，但需進(jin)行活(huo)細(xi)胞培(pei)養(yang)或(huo)細(xi)胞分(fen)離，影響(xiang)因(yin)素多(duo)，重(zhong)復(fu)性較(jiao)差，目前僅適(shi)用(yong)於(yu)實驗研究(jiu)。此(ci)類(lei)技(ji)術有(you)多(duo)種(zhong)方法(fa)。

    Raji細胞是(shi)從Burkitt淋巴瘤(liu)患(huan)者(zhe)分(fen)離建株的(de)B淋巴細胞系。可(ke)在(zai)體外連續傳(chuan)代(dai)培養，細(xi)胞表(biao)面(mian)沒(mei)有(you)膜(mo)免疫(yi)球蛋(dan)白(bai)，Pc受(shou)體的(de)親和力很低(di)，但有(you)C3、C3b和C3d受(shou)體及(ji)Clq受(shou)體，而(er)且不(bu)易脫落(luo)。因(yin)此(ci)能(neng)使(shi)結合(he)補體的(de)IC吸附在細(xi)胞上(shang)，然後(hou)再(zai)於(yu)反應系統(tong)中加(jia)入(ru)熒光(guang)素或(huo)i25標記的(de)抗人(ren)IgG抗體，使(shi)其(qi)與結合(he)在Raji細(xi)胞上(shang)的(de)IC中的(de)IRC反應，計算(suan)Rail細(xi)胞上(shang)結合(he)的(de)IC中滲(shen)入(ru)的(de)核(he)素量(liang)，即(ji)可(ke)判(pan)定(ding)IC的(de)存(cun)在與含量(liang)。

(壹(yi))試(shi)劑(ji)

    ．Raji細胞懸(xuan)液  將(jiang)Raji細胞培(pei)養(yang)在(zai)含20％小(xiao)牛血清的(de)RPMI-640培養(yang)液中2—3d後(hou)即(ji)可收集應用(yong)，該細胞培(pei)養(yang)時(shi)不(bu)貼壁、不(bu)結團，生長容(rong)易(壹(yi)般(ban)3d即可(ke)傳(chuan)壹(yi)代)，培養(yang)條(tiao)件不(bu)苛求(qiu)。但pH值(zhi)應在6．5左(zuo)右，超過pH7．0則生長不(bu)良(liang)。收集細(xi)胞時(shi)要計數(shu)和檢查(zha)活(huo)細(xi)胞，臺(tai)盼藍(lan)排(pai)除(chu)試(shi)驗要求活(huo)細(xi)胞在(zai)95％以(yi)上(shang)。

    2．核(he)素標記抗IgC抗體  將(jiang)兔抗(kang)人(ren)IgC血清經(jing)DE52分(fen)離兔IsC，用(yong)PBS稀(xi)釋成(cheng)蛋白(bai)質mg／mL，按每ug蛋白(bai)質結合(he)0．3uCi25I標記抗人IgC抗(kang)體。

(二(er))操作步驟(zhou)

    ．取培養(yang)72h的(de)Raji細胞 800r／rain離心(xin)0rain，棄去上(shang)清(qing)液，細(xi)胞沈(chen)澱中加(jia)入(ru)不(bu)含小(xiao)牛血清的(de)640培養(yang)液，洗2次。

    2．計數(shu)Raji細(xi)胞數(shu)，用(yong)*640培養(yang)液配成07／mL細(xi)胞懸(xuan)液。

    3．取滴細(xi)胞懸(xuan)液加(jia)等量(liang)0．％臺(tai)盼藍(lan)，放37℃0rain，鏡檢著(zhe)色細(xi)胞不(bu)應超過5％。

    4．在(zai)試(shi)管中加(jia)入(ru)細(xi)胞懸(xuan)液50~L，再(zai)加入(ru)：4稀(xi)釋的(de)受(shou)檢血清25uL。

    5．搖勻後(hou)放(fang)37~(2 45rain，每5-0rain輕搖壹次，使(shi)其(qi)充分(fen)作用(yong)。

    6．用(yong)640培養(yang)液將(jiang)細胞洗滌(di)3次， 000r／min離心(xin)5min，棄去上(shang)清(qing)液。

    7．在(zai)細胞沈(chen)澱物(wu)中加(jia)25I標記的(de)抗人(ren)TgG抗體，用(yong)含％人血清白(bai)蛋白(bai)(HSA)的(de)640培養(yang)液將(jiang)標記物稀(xi)釋成(cheng)7-0ug／mL。加入(ru)標記物後(hou)置(zhi)4℃30min，每間隔(ge)5—0min輕(qing)搖次。

    8．用(yong)含％人血清白(bai)蛋白(bai)(HSA)的(de)640培養(yang)液洗滌(di)3次，每次 800r／rain離心(xin)0min。

    9．取細胞沈(chen)積物(wu)用(yong)Y計數(shu)器(qi)測(ce)cpm值(zhi)。

  0．用(yong)熱(re)變性(xing)IgG40ug溶(rong)於(yu)50uL新鮮(xian)混合(he)人血清中，然後(hou)倍比稀(xi)釋成(cheng)0個稀(xi)釋度(du)，按上(shang)述方法操作測(ce)定(ding)cpm。

(三(san))結果(guo)判(pan)斷(duan)

    以(yi)熱(re)聚合(he)IgC的(de)含量(liang)為(wei)橫(heng)坐標，cpm為(wei)縱(zong)坐標繪制標準參考(kao)曲線(xian)。自參考(kao)曲線(xian)查(zha)出IC中IgC的(de)ug數(shu)，按(an)ug/mL報(bao)告(gao)。

(四(si))註(zhu)意(yi)事項

    ．Raji細胞有(you)時(shi)也帶(dai)有(you)Pc受(shou)體和表(biao)面(mian)膜(mo)免疫(yi)球蛋(dan)白(bai)，為(wei)使(shi)實驗結果(guo)反(fan)映真(zhen)實情況(kuang)，應預(yu)試(shi)條(tiao)件，同(tong)時(shi)在(zai)實驗中加(jia)陰性對照。

    2．用(yong)熱(re)變性(xing)IsC作對照和參考(kao)時(shi)，壹(yi)定(ding)要用(yong)新鮮(xian)血清作稀(xi)釋劑(ji)，以補(bu)充補(bu)體。

除(chu)此(ci)以(yi)外，細胞受(shou)體結合(he)免疫(yi)測(ce)定(ding)方(fang)法(fa)中的(de)血小(xiao)板凝(ning)集試(shi)驗亦用(yong)於(yu)實驗研究(jiu)。其(qi)原(yuan)理是(shi)免疫復合(he)物與(yu)血小(xiao)板相互(hu)作用(yong)後(hou)引(yin)起(qi)血小(xiao)板表(biao)面(mian)發生改(gai)變，導(dao)致(zhi)血小(xiao)板凝(ning)集(有(you)人(ren)認為(wei)血小(xiao)板凝(ning)集與(yu)其(qi)表(biao)面(mian)Fc受(shou)體活(huo)化(hua)有(you)關(guan))。試(shi)驗中必(bi)須采(cai)用(yong)新鮮(xian)分(fen)離的(de)有(you)活(huo)力的(de)血小(xiao)板，因(yin)為(wei)在(zai)IC存(cun)在時(shi)，血小(xiao)板表(biao)面(mian)的(de)改(gai)變有(you)賴於(yu)其(qi)代謝(xie)狀(zhuang)態。除(chu)IC外，高濃度(du)的(de)遊(you)離免疫球蛋(dan)白(bai)與血小(xiao)板表(biao)面(mian)抗原(yuan)反應的(de)抗體和其(qi)他物質，如荷電(dian)分(fen)子(zi)、蛋白(bai)水(shui)解(jie)酶(mei)和某(mou)些(xie)粘(zhan)病毒也可(ke)使(shi)血小(xiao)板聚集；Clq、IgM、RF能(neng)抑(yi)制IC引起(qi)的(de)血小(xiao)板聚集；待檢血清於(yu)試(shi)驗前加熱(re)滅活(huo)，會使(shi)其(qi)血小(xiao)板凝(ning)集滴(di)度(du)升(sheng)高或(huo)降低(di)。