谷(gu)研(yan)試(shi)劑(ji)-常(chang)用蛋白質(zhi)與(yu)非(fei)蛋白含(han)氮(dan)化合物檢(jian)測項(xiang)目(mu)（壹）

谷研(yan)試(shi)劑(ji)-常(chang)用蛋白質(zhi)與(yu)非(fei)蛋白含(han)氮(dan)化合物檢(jian)測項(xiang)目(mu)（壹）

壹、體(ti)液總蛋白

體(ti)液總蛋白包括數(shu)量眾(zhong)多(duo)的各種蛋白質(zhi)，在(zai)進行定(ding)量(liang)測定時作了如下(xia)假(jia)定(ding)：①所有(you)蛋白質(zhi)都(dou)是單(dan)純(chun)的多(duo)肽(tai)鏈(lian)，糖(tang)脂類和金屬有(you)機(ji)物等(deng)均(jun)不(bu)計(ji)在(zai)內，其含氮(dan)量平(ping)均(jun)為(wei)6％；②各種蛋白質(zhi)理(li)化性質(zhi)雖不(bu)同(tong)，但與化(hua)學(xue)試劑(ji)的反應(ying)性(xing)壹致。顯(xian)然(ran)，這(zhe)過於理想(xiang)化(hua)，因(yin)此(ci)任(ren)何(he)壹種(zhong)化(hua)學方(fang)法測定(ding)體(ti)液總蛋白，均(jun)存(cun)在(zai)壹定(ding)的缺(que)陷(xian)。測定(ding)蛋白質(zhi)壹般利(li)用(yong)蛋白質(zhi)*的結構或(huo)

性(xing)質(zhi)：①重復的肽(tai)鏈(lian)結構；②分(fen)子中(zhong)均(jun)含有(you)氮(dan)原子；③與(yu)色(se)素(su)結合的能(neng)力(li)；④沈(chen)澱(dian)後(hou)借(jie)濁度或(huo)光(guang)折射測(ce)定(ding)；⑤和殘基(ji)對(dui)酚(fen)試(shi)劑(ji)反應(ying)或(huo)被(bei)紫外光(guang)吸(xi)收。臨(lin)床(chuang)實(shi)驗(yan)室(shi)利(li)用(yong)以(yi)上(shang)原理測定體(ti)液蛋白質(zhi)的方(fang)法有(you)多(duo)種(zhong)，各種方(fang)法性能(neng)和(he)應(ying)用(yong)情(qing)況不(bu)同(tong)，zui常用的是(shi)雙(shuang)縮脲(niao)法，以下(xia)將(jiang)重點(dian)介紹。

(壹)雙(shuang)縮脲(niao)法

【檢測(ce)原理】蛋白質(zhi)中(zhong)的兩(liang)個(ge)相(xiang)鄰肽鍵(壹CO—NH壹)在(zai)堿(jian)性(xing)溶(rong)液中能(neng)與(yu)二(er)價(jia)銅離子(Cu。’)作(zuo)用產(chan)生穩(wen)定的紫紅(hong)色(se)絡(luo)合物。此(ci)反應(ying)與(yu)雙(shuang)縮脲(niao)(H：N—Oc—NH—CO—NH：，為(wei)兩(liang)個(ge)尿(niao)素(su)分(fen)子縮合而(er)成(cheng))在(zai)堿(jian)性(xing)溶(rong)液中與Cu。’作用(yong)形(xing)成(cheng)紫紅(hong)色(se)的反應(ying)相(xiang)似，因此(ci)，將(jiang)蛋白質(zhi)與(yu)堿性銅(tong)反應(ying)的方(fang)法稱(cheng)為(wei)雙(shuang)縮脲(niao)法(biuret，．method)。

【參考(kao)區間】血(xue)漿(jiang)總蛋白隨(sui)年齡(ling)增(zeng)大有(you)所增高，60歲後(hou)則稍有(you)下(xia)降(jiang)。新生兒為(wei)46～70g／L，數(shu)月齡到(dao)2歲為(wei)5～75g／L，3歲及(ji)以(yi)上為(wei)60~80g／L，成(cheng)人(ren)為(wei)64～83g／L(直立行走(zou))和60~78g／L(臥(wo)床(chuang))。

【臨(lin)床(chuang)意義】血漿(jiang)總蛋白濃度下(xia)降(jiang)常(chang)由(you)白(bai)蛋白濃度下(xia)降(jiang)引起；濃度增(zeng)高(gao)主要見(jian)於慢性(xing)炎癥等(deng)多(duo)克(ke)隆免(mian)疫球蛋白增(zeng)多(duo)，以(yi)及漿(jiang)細胞病的單(dan)克(ke)隆免(mian)疫球蛋白增(zeng)多(duo)癥。

【評(ping)價(jia)】

·特(te)異性(xing) 因(yin)至少含兩(liang)個(ge)…CO NH 基(ji)團才能(neng)與(yu)Cu。’絡(luo)合，故(gu)氨基(ji)酸(suan)及二(er)肽(tai)無(wu)反應(ying)，三(san)肽(tai)以上才能(neng)反應(ying)。體(ti)液小分(fen)子肽(tai)含量(liang)極(ji)低(di)，對(dui)蛋白質(zhi)來(lai)說(shuo)可(ke)忽略不(bu)計(ji)。

2·呈(cheng)色(se)壹致性(xing) 因(yin)呈(cheng)色(se)強度與(yu)肽(tai)鍵數(shu)量即(ji)蛋白質(zhi)含(han)量成(cheng)正(zheng)比，因此各種蛋白質(zhi)呈(cheng)色(se)強度基(ji)本(ben)相(xiang)同，在(zai)目(mu)前(qian)所有(you)總蛋白測(ce)定(ding)方(fang)法中。

3·臨(lin)床(chuang)應(ying)用(yong) 本(ben)法檢測(ce)範圍(wei)為(wei)0～20g／L，靈(ling)敏(min)度不(bu)高(gao)，但很(hen)適合血(xue)清(qing)總(zong)蛋白濃度測(ce)定(ding)，絕(jue)大(da)多(duo)數(shu)正(zheng)常和病理(li)血清總(zong)蛋白均(jun)在(zai)其檢測(ce)範(fan)圍內。雙(shuang)縮脲(niao)法測定(ding)胸腹水總蛋白的檢(jian)測(ce)低(di)限(xian)為(wei)0．47g／L，生(sheng)物檢(jian)測限(xian)為(wei)．33g／L，胸(xiong)腹腔(qiang)積液總蛋白多(duo)數(shu)在(zai)4．5～50g／L，因(yin)此(ci)能(neng)采用(yong)該法測定(ding)。對(dui)蛋白質(zhi)濃度很(hen)低(di)的腦(nao)脊液和尿液，該法不(bu)是(shi)合適的定(ding)量(liang)方(fang)法。

(二)測(ce)定體(ti)液總蛋白的其他(ta)方(fang)法

·染(ran)料(liao)結合法在(zai)酸(suan)性環(huan)境下(xia)，蛋白質(zhi)帶(dai)正(zheng)電荷(he)，可(ke)與染(ran)料(liao)陰離子反應(ying)而(er)產(chan)生顏(yan)色(se)改(gai)變(bian)，常(chang)用(yong)染(ran)料(liao)有(you)氨基(ji)黑、麗春(chun)紅(hong)、考馬(ma)斯(si)亮(liang)藍、鄰(lin)苯三酚(fen)紅(hong)鉬(mu)等。前(qian)兩種(zhong)常作為(wei)血(xue)白(bai)蛋白電(dian)泳(yong)的染(ran)料(liao)。考(kao)馬(ma)斯(si)亮(liang)藍常(chang)用於需更高呈(cheng)色(se)靈(ling)敏(min)度的蛋白電(dian)泳(yong)中，也可(ke)用於尿液、腦(nao)脊液等樣品的蛋白質(zhi)定(ding)量測定(ding)，優點(dian)是簡便、快速(su)、靈(ling)敏(min)，但比(bi)色(se)杯對(dui)染(ran)料(liao)有(you)吸(xi)附(fu)作用(yong)，在(zai)自(zi)動(dong)生化分(fen)析儀中無(wu)法很(hen)好(hao)地(di)清洗(手(shou)工(gong)清(qing)洗常采用(yong)乙(yi)醇)。染(ran)料(liao)結合法均(jun)存(cun)在(zai)不(bu)同(tong)蛋白質(zhi)與(yu)染(ran)料(liao)結合力(li)不(bu)壹致的問題(ti)。

目前(qian)臨(lin)床(chuang)上zui常(chang)用(yong)的是(shi)鄰(lin)苯三酚(fen)紅(hong)鉬(mu)(pyrogallol red molybdate，PRM)法。其原理是：在(zai)酸(suan)性介(jie)質(zhi)中(zhong)，鄰苯三酚(fen)紅(hong)壹鉬(mu)酸(suan)鹽與(yu)樣品中的蛋白質(zhi)形(xing)成(cheng)復(fu)合物，使(shi)其zui大吸(xi)收峰從(cong)467nm轉移至594nm，在(zai)600nto處的吸(xi)光(guang)度與(yu)蛋白質(zhi)濃度成(cheng)正(zheng)比。本(ben)法靈(ling)敏(min)度高(gao)，檢(jian)測(ce)F限(xian)為(wei)lO~20mg／L，多(duo)數(shu)試劑(ji)盒的檢(jian)測(ce)上限(xian)約(yue)為(wei)2g／L。試(shi)劑(ji)不(bu)吸(xi)附(fu)比色(se)杯，可(ke)用於自(zi)動(dong)生化分(fen)析儀中。不(bu)足(zu)之處仍(reng)然(ran)是試(shi)劑(ji)與(yu)各種蛋白質(zhi)的呈(cheng)色(se)

2·凱氏(shi)定氮(dan)法(Kjeldahl method)該法於883年建立，是經(jing)典(dian)的蛋白質(zhi)測(ce)定方(fang)法。其原理是：測定樣(yang)品中的含(han)氮(dan)量，推(tui)算出樣(yang)品中的蛋白質(zhi)含(han)量。蛋白質(zhi)中(zhong)含氮(dan)量較為(wei)恒(heng)定，平(ping)均(jun)6％，即(ji)lg氮(dan)相(xiang)當於6．25g蛋白質(zhi)。含(han)氮(dan)化合物用(yong)硫酸(suan)加熱分(fen)解(jie)，在(zai)有(you)催(cui)化(hua)劑(ji)存(cun)在(zai)的條(tiao)件(jian)下(xia)，生(sheng)成(cheng)硫(liu)酸(suan)銨(an)，後者再(zai)與濃堿(jian)作用(yong)生成(cheng)NH。OH，采用(yong)蒸(zheng)餾(liu)法將(jiang)氨蒸(zheng)餾(liu)並被硼酸(suan)吸(xi)收，將(jiang)硼酸(suan)銨(an)用標準鹽酸(suan)滴定(ding)。根(gen)據(ju)標準鹽酸(suan)的消耗量(liang)可算出總(zong)氮(dan)量，再(zai)折算成(cheng)蛋白質(zhi)含(han)量。該法定量(liang)準確(que)性好(hao)，精(jing)密(mi)度高(gao)，靈(ling)敏(min)度高(gao)，並(bing)適用於任何(he)形態的樣(yang)品測定，至(zhi)今(jin)仍被(bei)認(ren)為(wei)是(shi)測(ce)定(ding)許多(duo)生(sheng)物樣(yang)品中蛋白質(zhi)含(han)量的參(can)考(kao)方(fang)法。但該法操(cao)作復(fu)雜、費(fei)時，不(bu)適合臨(lin)床(chuang)常規(gui)測(ce)定(ding)。樣品中各種蛋白質(zhi)含(han)氮(dan)量有(you)少許差異(yi)，尤(you)其在(zai)疾病狀(zhuang)態下(xia)差異(yi)可(ke)能(neng)更大。對(dui)於非(fei)蛋白含(han)氮(dan)化合物較高(gao)的血(xue)清(qing)樣品，則還要測(ce)定無(wu)蛋白血(xue)濾(lv)液中非(fei)蛋白氮(dan)含量(liang)並將(jiang)其扣(kou)除(chu)。

3·比(bi)濁(zhuo)法(turbidimetry) 某(mou)些(xie)酸(suan)如三(san)氯乙(yi)酸(suan)、磺基(ji)水楊酸(suan)等能(neng)與(yu)蛋白質(zhi)結合而(er)產(chan)生(sheng)微(wei)細沈(chen)澱(dian)，由(you)此(ci)產(chan)生(sheng)的懸(xuan)浮(fu)液濁度大(da)小(xiao)與(yu)蛋白質(zhi)的濃度成(cheng)正(zheng)比。該法的優(you)點(dian)是操(cao)作簡便、靈(ling)敏(min)度高(gao)，可(ke)用(yong)於測定(ding)尿(niao)液、腦(nao)脊液等蛋白質(zhi)濃度較低(di)的樣(yang)品；缺點(dian)是影響濁度大(da)小(xiao)的因(yin)素(su)較多(duo)，包括加入(ru)試(shi)劑(ji)的手(shou)法、混勻技術(shu)、反應(ying)溫(wen)度等(deng)，且(qie)各種蛋白質(zhi)形(xing)成(cheng)的濁(zhuo)度亦(yi)有(you)較大(da)的差別(bie)。目(mu)前(qian)臨(lin)床(chuang)上較多(duo)應(ying)用(yong)的是(shi)芐(bian)乙(yi)氯銨(an)法，其原理是：芐乙(yi)氯銨(an)在(zai)堿(jian)性(xing)條(tiao)件(jian)下(xia)與(yu)蛋白質(zhi)形(xing)成(cheng)沈(chen)澱(dian)，其懸浮(fu)液穩(wen)定，可(ke)在(zai)660nm處進行濁(zhuo)度測(ce)定(ding)。該法是比(bi)濁法中較好(hao)的方(fang)法，其靈(ling)敏(min)度、準(zhun)確(que)度以(yi)及(ji)對(dui)白(bai)蛋白和(he)球(qiu)蛋白的反應(ying)壹致性(xing)都(dou)優(you)於其他(ta)比濁法，檢測(ce)範圍(wei)較廣(guang)，可(ke)用(yong)於自(zi)動(dong)化分(fen)析，然(ran)而(er)其精(jing)密(mi)度仍(reng)不(bu)夠理想(xiang)。

4．酚(fen)試(shi)劑(ji)法(phenol reagent method) 由(you)Folin於92年*，早期用於和測(ce)定(ding)，後(hou)由(you)吳(wu)憲(xian)開始(shi)用(yong)於蛋白質(zhi)定(ding)量。酚(fen)試(shi)劑(ji)法的原理是運用蛋白質(zhi)中(zhong)和使(shi)磷鎢酸(suan)和磷鉬(mu)酸(suan)還原為(wei)鎢藍和(he)鉬(mu)藍。該法靈(ling)敏(min)度較高(gao)。Lowry將(jiang)酚(fen)試(shi)劑(ji)法進行了改(gai)良(liang)，先用堿性銅(tong)溶(rong)液與蛋白質(zhi)反應(ying)，再(zai)將(jiang)銅．肽(tai)鍵絡(luo)合物中(zhong)的和(he)與(yu)酚(fen)試(shi)劑(ji)反應(ying)，產(chan)生(sheng)zui大吸(xi)收在(zai)745～750nm的顏(yan)色(se)，使(shi)呈(cheng)色(se)靈(ling)敏(min)度更為(wei)提(ti)高(gao)，達(da)到(dao)雙(shuang)縮脲(niao)法的00倍左右，有(you)利(li)於檢出(chu)較微(wei)量的蛋白質(zhi)。各種蛋白質(zhi)中(zhong)和的含(han)量(liang)不(bu)同(tong)，如白(bai)蛋白含(han)0．2％，而(er)球蛋白含(han)2％～3％，因(yin)此本(ben)法不(bu)適合測(ce)定(ding)混(hun)合蛋白質(zhi)，只(zhi)適合測(ce)定(ding)單(dan)壹蛋白質(zhi)，如測(ce)定組(zu)織(zhi)中(zhong)某(mou)壹蛋白質(zhi)抽(chou)提物。該法易(yi)受還原性化合物的幹(gan)擾(rao)，如帶(dai)壹SH的化(hua)合物、糖(tang)類、酚(fen)類(lei)等(deng)。

5．直接紫外吸(xi)收法根據(ju)蛋白質(zhi)分(fen)子在(zai)280nm或(huo)25／225nm的紫外吸(xi)光(guang)度值(zhi)計(ji)算蛋白質(zhi)含(han)量。其原理是：芳香族(zu)氨基(ji)酸(suan)在(zai)280nm處有(you)壹吸(xi)收峰，可用於蛋白質(zhi)的測(ce)定(ding)。因生(sheng)物樣(yang)品常混有(you)核酸(suan)，核酸(suan)zui大吸(xi)收峰為(wei)260nm，在(zai)280nm也(ye)有(you)較強的光(guang)吸(xi)收，因而測得(de)的蛋白質(zhi)濃度可(ke)采用(yong)兩個(ge)波(bo)長的吸(xi)光(guang)度予(yu)以(yi)校正(zheng)，即(ji)蛋白質(zhi)濃度(g／I。)：．4：80nto。壹0．74A：60nm。該法準確(que)性受(shou)蛋白質(zhi)分(fen)子中(zhong)芳香族(zu)氨基(ji)酸(suan)的含(han)量(liang)影響甚(shen)大(da)，而(er)且(qie)尿酸(suan)和在(zai)280nm附(fu)近(jin)有(you)幹擾(rao)，所以不(bu)適合血(xue)清(qing)、尿(niao)液等組成(cheng)復(fu)雜的體(ti)液蛋白質(zhi)測(ce)定，常用(yong)於較純(chun)的酶(mei)、免(mian)疫球蛋白等(deng)測(ce)定。本(ben)法不(bu)加任(ren)何(he)試劑(ji)且(qie)不(bu)需(xu)要處理(li)，可(ke)保留(liu)制劑(ji)的生(sheng)物活性(xing)，可回收全(quan)部蛋白質(zhi)。