細胞培養(yang)基(ji)純化(hua)實驗和包(bao)被(bei)液(ye)的操(cao)作(zuo)過(guo)程

細胞培養(yang)基(ji)純化(hua)實驗和包(bao)被(bei)液(ye)的操(cao)作(zuo)過(guo)程

　純化(hua)實驗操(cao)作(zuo)步驟：

    ．去除(chu)培(pei)養(yang)液(ye)；

　　2．×無(wu)鈣(gai)鎂PBS洗(xi)滌；

　　3．加入(ru)×EDTA(0×EDTA用PBS稀釋(shi)。)37℃孵育5分(fen)鐘(zhong)。

　　4．加入(ru)ES培養(yang)基(ji)使失(shi)活；

　　5．將細胞轉(zhuan)入(ru)5ml離(li)心管中(zhong)離(li)心3min；

　　6．去除(chu)上清，將細胞重懸於(yu)2mlES培(pei)養(yang)基(ji)，至少吹打0－20次(ci)。

　　如果加入(ru)培養(yang)基(ji)的(de)量(liang)較少會比較容(rong)易將細胞團弄散分(fen)開。ES細胞有聚集成(cheng)團(tuan)的傾(qing)向，傳(chuan)代過(guo)程中(zhong)仔細將細胞弄散分(fen)開很(hen)重(zhong)要(yao)。這(zhe)樣(yang)可能會減少細胞的自(zi)然(ran)分(fen)化(hua)。

　　7．將細胞接種(zhong)在(zai)沒有包被(bei)的組(zu)織培養(yang)皿(min)中(zhong)（使用(yong)和(he)壹開始(shi)同(tong)樣(yang)規格的培養(yang)皿(min)）放入(ru)溫箱(xiang)2小時（分(fen)化(hua)細胞在該時間(jian)內(nei)將黏附(fu)，而ES細胞仍將保(bao)持懸(xuan)浮）；

　　8．將含(han)有細胞的培養(yang)基(ji)轉(zhuan)入(ru)明膠包(bao)被(bei)的組(zu)織培養(yang)皿(min)。吹打以(yi)確(que)保(bao)細胞被(bei)分(fen)散(san)開。

　　9．建(jian)議(yi)按：4－：0的(de)比率傳(chuan)代(ATCC)

　　保持(chi)細胞的傳(chuan)代比率(lv)很(hen)重(zhong)要(yao)，以(yi)我(wo)們(men)的(de)經驗，：8的比(bi)率是(shi)好(hao)的(de)，可(ke)以(yi)使細胞的自(zi)然(ran)分(fen)化(hua)降到(dao)zui低(di)。當妳使用(yong)不同規格的培養(yang)板(ban)進(jin)行細胞傳(chuan)代可以(yi)使用(yong)表(biao)來(lai)計(ji)算傳(chuan)代比率(lv)。

包(bao)被(bei)液(ye)的準備(bei)：

　　多聚(ju)-L-，5μg/ml

　　把75ml多聚(ju)-L-和425ml ×PBS混(hun)合。貯(zhu)存在4℃。

　　纖(xian)維(wei)結合蛋(dan)白(bai)，μg/ml

　　把0.5ml纖(xian)維(wei)結合蛋(dan)白(bai)和500ml ×PBS混(hun)合。

　　包(bao)被(bei)過(guo)程：

　　．加入(ru)多聚(ju)-L-，至少2－3小時（過(guo)夜(ye)也行）

　　2．吸出(chu)多聚(ju)-L-

　　3．加入(ru)纖(xian)維(wei)結合蛋(dan)白(bai)，大(da)約(yue)－2小(xiao)時

　　4．吸(xi)出(chu)纖(xian)維(wei)結合蛋(dan)白(bai)，放置(zhi)30分(fen)鐘(zhong)晾幹(gan)

　　5．貯(zhu)存在4℃

　　24孔(kong)板用(yong)200μl，6孔(kong)板(ban)用(yong)500μl。震蕩(dang)培養(yang)板(ban)確(que)保(bao)溶液(ye)能夠(gou)覆(fu)蓋(gai)蓋(gai)玻片(pian)或培養(yang)基(ji)孔(kong)。有(you)時需(xu)要(yao)劇(ju)烈震(zhen)蕩(dang)培(pei)養(yang)板(ban)。