人促甲(jia)狀(zhuang)腺素(su)釋(shi)放(fang)激(ji)素(su)（TRH）ELISA試(shi)劑盒實驗(yan)說(shuo)明(ming)

人促甲(jia)狀(zhuang)腺素(su)釋(shi)放(fang)激(ji)素(su)（TRH）ELISA試(shi)劑盒實驗(yan)說(shuo)明(ming)

實驗(yan)原(yuan)理：
人促甲(jia)狀(zhuang)腺素(su)釋(shi)放(fang)激(ji)素(su)（TRH）ELISA試(shi)劑盒應用(yong)雙(shuang)抗體(ti)夾心法(fa)測(ce)定標本中人促甲(jia)狀(zhuang)腺素(su)釋(shi)放(fang)激(ji)素(su)（TRH）水(shui)平(ping)。用(yong)純(chun)化(hua)的(de)人促甲(jia)狀(zhuang)腺素(su)釋(shi)放(fang)激(ji)素(su)（TRH）抗(kang)體(ti)包被(bei)微(wei)孔板，制(zhi)成固相(xiang)抗(kang)體(ti)，往(wang)包被(bei)單抗的(de)微(wei)孔中(zhong)依次加入促甲(jia)狀(zhuang)腺素(su)釋(shi)放(fang)激(ji)素(su)（TRH），再與HRP標(biao)記的(de)促(cu)甲(jia)狀(zhuang)腺素(su)釋(shi)放(fang)激(ji)素(su)（TRH）抗(kang)體(ti)結(jie)合(he)，形(xing)成抗體(ti)-抗(kang)原(yuan)-酶(mei)標抗體(ti)復合(he)物，經(jing)過*洗滌(di)後(hou)加底物(wu)TMB顯色(se)。TMB在HRP酶(mei)的(de)催化(hua)下(xia)轉化(hua)成(cheng)藍(lan)色(se)，並(bing)在酸(suan)的(de)作用(yong)下(xia)轉化(hua)成(cheng)zui終的(de)黃(huang)色(se)。顏(yan)色(se)的(de)深(shen)淺(qian)和樣品中(zhong)的(de)促(cu)甲(jia)狀(zhuang)腺素(su)釋(shi)放(fang)激(ji)素(su)（TRH）呈正相(xiang)關(guan)。用(yong)酶(mei)標儀在450nm波長(chang)下(xia)測(ce)定吸光度（OD值），通(tong)過標準(zhun)曲(qu)線(xian)計(ji)算(suan)樣品中(zhong)人促甲(jia)狀(zhuang)腺素(su)釋(shi)放(fang)激(ji)素(su)（TRH）水(shui)平(ping)。

操作步驟(zhou)
. 人促甲(jia)狀(zhuang)腺素(su)釋(shi)放(fang)激(ji)素(su)（TRH）ELISA試(shi)劑盒標(biao)準(zhun)品的(de)稀(xi)釋(shi)與加(jia)樣(yang)：在酶(mei)標包被(bei)板上設標準(zhun)品孔0孔，在*、第(di)二(er)孔中(zhong)分別(bie)加(jia)標(biao)準品00μl，然(ran)後(hou)在*、第(di)二(er)孔中(zhong)加標(biao)準(zhun)品稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混勻(yun)；然(ran)後(hou)從(cong)*孔、第(di)二(er)孔中(zhong)各(ge)取00μl分別加到第(di)三孔和第(di)四孔，再在第(di)三、第(di)四孔分(fen)別加(jia)標(biao)準(zhun)品稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混勻(yun)；然(ran)後(hou)在第(di)三孔和第(di)四孔中(zhong)先各(ge)取50μl棄掉，再各(ge)取50μl分別加到第(di)五、第(di)六孔中(zhong)，再在第(di)五、第(di)六孔中(zhong)分別(bie)加(jia)標(biao)準品稀(xi)釋(shi)液(ye)50ul，混勻(yun)；混勻(yun)後(hou)從(cong)第(di)五、第(di)六孔中(zhong)各(ge)取50μl分別加到第(di)七、第(di)八(ba)孔中(zhong)，再在第(di)七、第(di)八(ba)孔中(zhong)分別(bie)加(jia)標(biao)準品稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混勻(yun)後(hou)從(cong)第(di)七、第(di)八(ba)孔中(zhong)分別(bie)取50μl加到第(di)九、第(di)十(shi)孔中(zhong)，再在第(di)九第(di)十(shi)孔分(fen)別加(jia)標(biao)準(zhun)品稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混勻(yun)後(hou)從(cong)第(di)九第(di)十(shi)孔中(zhong)各(ge)取50μl棄掉。（稀(xi)釋(shi)後(hou)各(ge)孔加(jia)樣量都為50μl，濃(nong)度分別(bie)為80U/mL, 20U/mL , 60U/mL, 30U/mL,5 U/mL）。
2. 加樣：分(fen)別設空(kong)白(bai)孔（空(kong)白對(dui)照(zhao)孔不(bu)加樣(yang)品及酶(mei)標試劑，其余(yu)各(ge)步操(cao)作相(xiang)同(tong)）、待(dai)測(ce)樣(yang)品孔。在酶(mei)標包被(bei)板上待測(ce)樣(yang)品孔中(zhong)先加(jia)樣(yang)品稀(xi)釋(shi)液(ye)40μl，然(ran)後(hou)再加(jia)待(dai)測(ce)樣(yang)品0μl（樣(yang)品zui終稀(xi)釋(shi)度為5倍）。加樣(yang)將樣品加(jia)於酶標板孔底部(bu)，盡量不觸(chu)及孔壁(bi)，輕輕晃動(dong)混勻(yun)。
3. 溫育(yu)：用(yong)封(feng)板膜封板後(hou)置37℃溫育(yu)30分(fen)鐘(zhong)。
4. 配(pei)液(ye)：將30（48T的(de)20倍(bei)）倍(bei)濃(nong)縮洗滌(di)液(ye)用(yong)蒸餾(liu)水30（48T的(de)20倍(bei)）倍(bei)稀(xi)釋(shi)後(hou)備用(yong)。
5. 洗滌(di)：小(xiao)心揭(jie)掉(diao)封板膜，棄去液體(ti)，甩(shuai)幹，每孔加(jia)滿(man)洗滌(di)液(ye)，靜(jing)置30秒後(hou)棄去，如此(ci)重(zhong)復5次，拍(pai)幹。
6. 加(jia)酶(mei)：每孔加(jia)入酶(mei)標(biao)試(shi)劑50μl，空白(bai)孔除外。
7. 人促甲(jia)狀(zhuang)腺素(su)釋(shi)放(fang)激(ji)素(su)（TRH）ELISA試(shi)劑盒溫育(yu)：操(cao)作同(tong)3。
8. 洗滌(di)：操(cao)作同(tong)5。
9. 顯色(se)：每孔先加(jia)入(ru)顯色(se)劑A50μl，再加(jia)入(ru)顯色(se)劑B50μl，輕輕震蕩混勻(yun)，37℃避光(guang)顯色(se)5分(fen)鐘(zhong).
0. 終止：每孔加(jia)終止液(ye)50μl，終止反(fan)應（此(ci)時(shi)藍色(se)立(li)轉黃(huang)色(se)）。
. 測(ce)定：以空白(bai)空調(tiao)零(ling)，450nm波長(chang)依序(xu)測(ce)量各(ge)孔的(de)吸(xi)光(guang)度（OD值）。 測(ce)定應在加(jia)終止液(ye)後(hou)5分鐘(zhong)以內進(jin)行(xing)。