人脫(tuo)氧(yang)吡啶酚（DPD）ELISA試劑盒(he)原理(li)

人脫氧(yang)吡啶酚（DPD）ELISA試劑盒(he)原理(li)

本(ben)試劑僅(jin)供(gong)研(yan)究(jiu)使用 標本(ben)：血清或(huo)血漿(jiang)

試驗原理(li)：

人脫(tuo)氧(yang)吡啶酚DPD試劑盒(he)是(shi)固相(xiang)夾(jia)心法(fa)酶(mei)聯(lian)免(mian)疫吸附實驗(yan)（ELISA）.已(yi)知(zhi)DPD濃度的(de)標(biao)準品(pin)、未(wei)知濃度的(de)樣(yang)品(pin)加入微孔(kong)酶(mei)標板(ban)內(nei)進行(xing)檢測(ce)。先(xian)將(jiang)DPD和標記(ji)的(de)抗(kang)體(ti)同時(shi)溫育。洗滌(di)後，加入(ru)親和素標(biao)記(ji)過的(de)HRP。再(zai)經過溫育和洗滌(di)，去(qu)除未(wei)結合(he)的(de)酶(mei)結合(he)物，然(ran)後加入(ru)底物A、B，和酶(mei)結合(he)物同時(shi)作(zuo)用。產生顏(yan)色。顏(yan)色的(de)深淺和樣(yang)品(pin)中DPD的濃度呈(cheng)比(bi)例(li)關系(xi)。

試(shi)劑盒(he)內(nei)容(rong)及其(qi)配制(zhi)：

人(ren)脫氧(yang)吡啶酚DPD自(zi)備材料：

. 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

2. 加樣(yang)器(qi)：5ul、0ul、50ul、00ul、200ul、500ul、000ul。

3. 振蕩(dang)器(qi)及(ji)磁(ci)力攪拌器(qi)等(deng)。

樣(yang)品(pin)收集、處理(li)及保存方法(fa)：

、血(xue)清(qing)……操作過程中(zhong)避免任(ren)何(he)細胞(bao)刺激。使用不含熱原和內(nei)毒素(su)的試(shi)管。收集血液後，000×g離心(xin)0分(fen)鐘(zhong)將(jiang)血(xue)紅細胞(bao)迅(xun)速小心地分離。

2、 血(xue)漿(jiang)……EDTA、檸檬酸(suan)鹽、肝素血漿(jiang)可(ke)用於檢(jian)測(ce)。000×g離心(xin)30分(fen)鐘(zhong)去(qu)除顆(ke)粒(li)。

3、 細(xi)胞上清液(ye)……000×g離心(xin)0分(fen)鐘(zhong)去(qu)除顆(ke)粒(li)和聚合(he)物。

4、 組(zu)織勻(yun)漿(jiang)……將(jiang)組(zu)織(zhi)加入適量生理(li)鹽水(shui)搗(dao)碎(sui)。000×g離心(xin)0分(fen)鐘(zhong)，取上清(qing)液。

5、 保存……如果(guo)樣(yang)品(pin)不立(li)即(ji)使用，應(ying)將(jiang)其分成(cheng)小部分(fen)-70℃保存，避免(mian)反(fan)復(fu)冷凍。盡(jin)可(ke)能(neng)的不要(yao)使用溶血(xue)或(huo)高(gao)血脂血(xue)。如(ru)果(guo)血清(qing)中大量顆粒(li)，檢(jian)測(ce)前先(xian)離心(xin)或(huo)過濾(lv)。不要(yao)在37℃或(huo)更高(gao)的溫度加(jia)熱解凍。應(ying)在室溫下(xia)解(jie)凍並(bing)確(que)保樣(yang)品(pin)均勻(yun)地充(chong)分解(jie)凍。

操作註意(yi)事(shi)項(xiang)：

●   人脫(tuo)氧(yang)吡啶酚DPD試劑應(ying)按標簽說明(ming)書儲(chu)存，使用前恢(hui)復到室溫。稀(xi)稀(xi)過後的標(biao)準品(pin)應(ying)丟(diu)棄，不可(ke)保存。

●   實驗(yan)中(zhong)不用的板(ban)條(tiao)應(ying)立(li)即(ji)放回包裝袋(dai)中，密(mi)封(feng)保存，以免(mian)變(bian)質(zhi)。

●   不用的其(qi)它試劑應(ying)包裝好(hao)或(huo)蓋好(hao)。不同批號的(de)試(shi)劑不要(yao)混(hun)用。保質前使用。

●   使用壹次(ci)性的(de)吸頭(tou)以(yi)免交叉(cha)汙(wu)染(ran)，吸取終(zhong)止(zhi)液和底物A、B液(ye)時，避(bi)免(mian)使用帶金屬(shu)部分(fen)的(de)加(jia)樣(yang)器(qi)。

●   使用幹(gan)凈的(de)塑(su)料容(rong)器(qi)配置(zhi)洗滌(di)液(ye)。使用前充(chong)分混(hun)勻(yun)試(shi)劑盒(he)裏(li)的各(ge)種(zhong)成(cheng)份(fen)及(ji)樣(yang)品(pin)。

●   底物A應(ying)揮(hui)發，避免長(chang)時間(jian)打開(kai)蓋子(zi)。底物B對(dui)光敏(min)感，避(bi)免(mian)長(chang)時間(jian)暴露(lu)於光下(xia)。避(bi)免(mian)用手(shou)接觸，有(you)毒。實驗(yan)完(wan)成(cheng)後應(ying)立(li)即(ji)讀(du)取OD值。

●   加入(ru)試劑的(de)順(shun)序應(ying)壹致(zhi)，以保證所有(you)反應(ying)板(ban)孔溫育的時間壹樣(yang)。

●   按照(zhao)說明(ming)書中(zhong)標明(ming)的時(shi)間、加液的量及順序進(jin)行(xing)溫育操作。

安(an)全性：

.   避(bi)免(mian)直接接觸終(zhong)止(zhi)液和底物A、B，壹旦接觸到(dao)這些(xie)液(ye)體，請(qing)盡(jin)快(kuai)用水(shui)沖洗(xi)。

2.   實難(nan)中(zhong)不要(yao)吃喝、抽煙或(huo)使用化妝(zhuang)品。

3.   不要(yao)用嘴(zui)吸取試劑盒(he)裏(li)的任(ren)何成(cheng)份(fen)。

人(ren)脫(tuo)氧(yang)吡啶酚DPD試劑的(de)準備：

.   標準品(pin)：標準品(pin)的系(xi)列(lie)稀(xi)釋(shi)應(ying)在實驗(yan)時(shi)準備，不能(neng)儲存(cun)。稀(xi)釋(shi)前將(jiang)標準品(pin)振蕩(dang)混(hun)勻(yun)。稀(xi)釋(shi)比(bi)例(li)按下(xia)表(biao)中(zhong)進(jin)行：

2.   洗(xi)滌(di)緩沖液（50×）的稀(xi)釋(shi)：蒸(zheng)餾(liu)水(shui)50倍(bei)稀(xi)釋(shi)。

人(ren)脫(tuo)氧(yang)吡啶酚DPD試劑盒(he)性能(neng)：

.   靈(ling)敏(min)度：zui小的檢(jian)測(ce)濃度小於號標(biao)準品(pin)。稀(xi)釋(shi)度的(de)線(xian)性。樣(yang)品(pin)線性回歸與(yu)預(yu)期(qi)濃度相(xiang)關系(xi)數(shu)R值為0.990。

2.   特異(yi)性：不與(yu)其它細胞因子(zi)反(fan)應(ying)。

3.   重(zhong)復性：板(ban)內(nei)、板(ban)間變異系(xi)數(shu)均小於0%。

操作步驟：

.   使用前，將(jiang)所有(you)試劑充(chong)分混(hun)勻(yun)。不要(yao)使液體產生大量的泡沫，以免(mian)加樣(yang)時(shi)加入大量的氣泡，產生加樣(yang)上(shang)的誤差(cha)。

2.   根據待測(ce)樣(yang)品(pin)數量加上標準品(pin)的數(shu)量決定(ding)所需的板(ban)條(tiao)數(shu)。每(mei)個標(biao)準品(pin)和空白孔建(jian)議(yi)做(zuo)復孔。每(mei)個樣(yang)品(pin)根據自(zi)己(ji)的數(shu)量來定(ding)，能(neng)使用復孔(kong)的盡(jin)量做復孔。

3.   加(jia)入(ru)稀(xi)釋(shi)好(hao)後的標(biao)準品(pin)50ul於反(fan)應(ying)孔(kong)、加入待測(ce)樣(yang)品(pin)50ul於反應(ying)孔(kong)內(nei)。立(li)即(ji)加入(ru)50ul的(de)標(biao)記(ji)的(de)抗(kang)體(ti)。蓋上(shang)膜(mo)板(ban)，輕輕振蕩(dang)混(hun)勻(yun)，37℃溫育45分鐘(zhong)。

4.   甩去(qu)孔(kong)內(nei)液體(ti)，每(mei)孔加(jia)滿洗(xi)滌(di)液(ye)，振蕩(dang)30秒(miao)，甩去(qu)洗(xi)滌(di)液(ye)，用吸水(shui)紙拍(pai)幹(gan)。重(zhong)復此(ci)操作4次(ci)。如果(guo)用洗板(ban)機(ji)洗滌(di)，洗(xi)滌(di)次(ci)數增(zeng)加壹次(ci)。

5.   每(mei)孔加(jia)入00ul的(de)親和鏈酶(mei)素-HRP，輕輕振蕩(dang)混(hun)勻(yun)，37℃溫育30分鐘(zhong)。

6.   人(ren)脫(tuo)氧(yang)吡啶酚DPD甩去(qu)孔(kong)內(nei)液體(ti)，每(mei)孔加(jia)滿洗(xi)滌(di)液(ye)，振蕩(dang)30秒(miao)，甩去(qu)洗(xi)滌(di)液(ye)，用吸水(shui)紙拍(pai)幹(gan)。重(zhong)復此(ci)操作4次(ci)。如果(guo)用洗板(ban)機(ji)洗滌(di)，洗(xi)滌(di)次(ci)數增(zeng)加壹次(ci)。

7.   每(mei)孔加(jia)入底物A、B各(ge)50ul，輕輕振蕩(dang)混(hun)勻(yun)，37℃溫育5分鐘(zhong)。避(bi)免(mian)光(guang)照(zhao)。

8.   取出酶(mei)標板(ban)，迅(xun)速加入(ru)50ul終(zhong)止(zhi)液，加(jia)入終(zhong)止(zhi)液後應(ying)立(li)即(ji)測(ce)定(ding)結果(guo)。

9.   在450nm波(bo)長(chang)處測(ce)定(ding)各孔(kong)的OD值。

結果(guo)判(pan)斷與(yu)分析(xi)：

、 儀器(qi)值：於波(bo)長(chang)450nm的酶(mei)標儀(yi)上讀(du)取各孔(kong)的OD值

2、 以吸光度OD值為縱(zong)坐標（Y），相(xiang)應(ying)的(de)DPD標準品(pin)濃度為橫坐(zuo)標（X），做(zuo)得相(xiang)應(ying)的(de)曲線，樣(yang)品(pin)的DPD含量可(ke)根據其OD值由(you)標準曲(qu)線換算(suan)出(chu)相(xiang)應(ying)的(de)濃度，再(zai)乘(cheng)以稀(xi)釋(shi)倍(bei)數；或(huo)用標準物的(de)濃度與(yu)OD值計(ji)算出(chu)標準曲(qu)線的(de)回歸方(fang)程式(shi)，將樣(yang)品(pin)的OD值代入方程式(shi)，計(ji)算出(chu)樣(yang)品(pin)濃度，再(zai)乘(cheng)以稀(xi)釋(shi)倍(bei)數，即(ji)為樣(yang)品(pin)的實際(ji)濃度。

3、 檢(jian)測(ce)值範圍(wei)： 0-500ng/ml

4、 敏(min)感度：.95ng/ml