人瘦(shou)素(su)ELISA試劑盒(he)操(cao)作(zuo)註意說(shuo)明

人瘦(shou)素(su)ELISA試劑盒(he)操(cao)作(zuo)註意說(shuo)明

人瘦(shou)素(su)試劑盒(he)是固(gu)相(xiang)夾心法(fa)酶聯(lian)免疫吸附實驗(yan)（ELISA）.已知Leptin濃(nong)度的標(biao)準(zhun)品(pin)、未(wei)知濃(nong)度的樣(yang)品(pin)加入(ru)微(wei)孔(kong)酶標(biao)板(ban)內(nei)進行(xing)檢(jian)測(ce)。先將(jiang)Leptin和(he)標記的抗(kang)體(ti)同(tong)時溫育。洗(xi)滌(di)後，加入(ru)親(qin)和素(su)標(biao)記(ji)過的HRP。再(zai)經過溫育和(he)洗滌(di)，去(qu)除(chu)未(wei)結合(he)的(de)酶結合(he)物(wu)，然後(hou)加入底物(wu)A、B，和(he)酶結合(he)物(wu)同時(shi)作(zuo)用。產(chan)生(sheng)顏(yan)色。顏(yan)色的深(shen)淺和樣品(pin)中Leptin的(de)濃(nong)度呈比例關(guan)系。

操(cao)作(zuo)註意事(shi)項

． 人瘦(shou)素(su)試劑應按標(biao)簽說(shuo)明書(shu)儲(chu)存，使(shi)用前(qian)恢復到(dao)室(shi)溫。稀(xi)稀(xi)過後的(de)標(biao)準(zhun)品(pin)應丟棄(qi)，不可(ke)保存。

2． 實驗(yan)中不用的(de)板(ban)條應立(li)即放回(hui)包裝袋中，密(mi)封(feng)保存，以(yi)免變質。

3． 不用的(de)其它試劑應包裝(zhuang)好(hao)或(huo)蓋(gai)好(hao)。不同(tong)批(pi)號的(de)試劑不要(yao)混(hun)用。保質前(qian)使(shi)用。

4． 使(shi)用壹(yi)次(ci)性(xing)的吸頭(tou)以(yi)免交叉(cha)汙(wu)染(ran)，吸取(qu)終止(zhi)液和(he)底物(wu)A、B液(ye)時，避免使(shi)用帶(dai)金(jin)屬部分(fen)的加樣(yang)器。

5． 使(shi)用幹(gan)凈(jing)的(de)塑料容(rong)器配(pei)置(zhi)洗(xi)滌(di)液。使(shi)用前(qian)充分(fen)混(hun)勻試劑盒(he)裏的各(ge)種成份及樣(yang)品(pin)。

6． 洗滌(di)酶標板(ban)時(shi)應(ying)充(chong)分(fen)拍(pai)幹(gan)，不要(yao)將(jiang)吸水(shui)紙直(zhi)接放入(ru)酶(mei)標(biao)反應孔中吸水(shui)。

7． 人瘦(shou)素(su)底物(wu)A應(ying)揮(hui)發，避(bi)免長時間打(da)開蓋(gai)子(zi)。底物(wu)B對(dui)光(guang)敏(min)感(gan)，避免長時間暴(bao)露(lu)於光(guang)下。避免用手(shou)接(jie)觸(chu)，有毒。實驗(yan)完(wan)成後(hou)應(ying)立(li)即讀(du)取OD值(zhi)。

8． 加(jia)入(ru)試劑的順(shun)序應壹(yi)致，以(yi)保證所(suo)有反(fan)應板(ban)孔(kong)溫育的(de)時間壹(yi)樣。

9． 按(an)照(zhao)說明書(shu)中標(biao)明(ming)的(de)時(shi)間、加(jia)液的(de)量及順(shun)序進行(xing)溫育操(cao)作(zuo)。

樣(yang)品(pin)收集(ji)、處(chu)理(li)及保存方法(fa)

、 血清(qing)-----操(cao)作(zuo)過程(cheng)中避(bi)免任何細胞(bao)刺(ci)激(ji)。使(shi)用不含熱原(yuan)和內(nei)毒素(su)的試管(guan)。收(shou)集血液後，000×g離(li)心0分(fen)鐘將(jiang)血(xue)清和紅細胞(bao)迅(xun)速小(xiao)心地(di)分(fen)離(li)。

2、 血漿(jiang)-----EDTA、檸(ning)檬酸(suan)鹽、肝素(su)血漿(jiang)可(ke)用於檢(jian)測(ce)。000×g離(li)心30分(fen)鐘去(qu)除(chu)顆粒。

3、 細胞(bao)上(shang)清(qing)液---000×g離(li)心0分(fen)鐘去(qu)除(chu)顆粒和聚(ju)合(he)物(wu)。

4、 保存------如(ru)果(guo)樣品(pin)不立(li)即使(shi)用，應(ying)將(jiang)其分(fen)成小(xiao)部分(fen)-70 ℃保存，避(bi)免反復冷(leng)凍。盡可(ke)能的不要(yao)使(shi)用溶血或(huo)高血(xue)脂(zhi)血(xue)。如(ru)果(guo)血清(qing)中大(da)量顆粒，檢(jian)測(ce)前(qian)先離(li)心或(huo)過濾。不要(yao)在37℃或(huo)更高(gao)的(de)溫度加熱解凍。應在(zai)室(shi)溫下解凍(dong)並確保樣品(pin)均勻地(di)充分(fen)解凍。

人瘦(shou)素(su)操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou)

． 使(shi)用前(qian)，將(jiang)所(suo)有試劑充分(fen)混(hun)勻。不要(yao)使(shi)液(ye)體產(chan)生(sheng)大(da)量的泡(pao)沫，以(yi)免加樣(yang)時(shi)加(jia)入(ru)大量的氣泡(pao)，產(chan)生(sheng)加(jia)樣(yang)上(shang)的(de)誤(wu)差。

2． 根(gen)據待測樣品(pin)數量加上(shang)標(biao)準(zhun)品(pin)的數(shu)量決(jue)定所(suo)需的(de)板(ban)條數。每(mei)個(ge)標準(zhun)品(pin)和空(kong)白(bai)孔(kong)建議(yi)做復孔。每(mei)個(ge)樣品(pin)根(gen)據自己的數(shu)量來定，能使(shi)用復孔的(de)盡量做復孔。

3． 加(jia)入稀(xi)釋(shi)好(hao)後(hou)的標準(zhun)品(pin)50ul於反(fan)應(ying)孔(kong)、加入待測樣品(pin)50ul於反(fan)應(ying)孔(kong)內(nei)。立(li)即加入50ul的標(biao)記(ji)的(de)抗(kang)體。蓋(gai)上(shang)膜板(ban)，輕輕振(zhen)蕩混(hun)勻，37℃溫育小(xiao)時。

4． 甩(shuai)去(qu)孔(kong)內(nei)液體(ti)，每(mei)孔加(jia)滿(man)洗(xi)滌(di)液，振蕩30秒，甩(shuai)去(qu)洗(xi)滌(di)液，用吸水(shui)紙拍(pai)幹(gan)。重(zhong)復此操(cao)作(zuo)3次(ci)。如(ru)果(guo)用洗(xi)板(ban)機(ji)洗滌(di)，洗滌(di)次數增(zeng)加壹次。

5． 每(mei)孔加(jia)入80ul的親(qin)和鏈酶素-HRP，輕輕振(zhen)蕩混(hun)勻，37℃溫育30分(fen)鐘。

6． 甩(shuai)去(qu)孔(kong)內(nei)液體(ti)，每(mei)孔加(jia)滿(man)洗(xi)滌(di)液，振蕩30秒，甩(shuai)去(qu)洗(xi)滌(di)液，用吸水(shui)紙拍(pai)幹(gan)。重(zhong)復此操(cao)作(zuo)3次(ci)。如(ru)果(guo)用洗(xi)板(ban)機(ji)洗滌(di)，洗滌(di)次數增(zeng)加壹次。

7． 每(mei)孔加(jia)入底物(wu)A、B各(ge)50ul，輕輕振(zhen)蕩混(hun)勻，37℃溫育0分(fen)鐘。避免光(guang)照(zhao)。

8． 取出酶(mei)標板(ban)，迅(xun)速加(jia)入(ru)50ul終止(zhi)液，加入終止(zhi)液後(hou)應立(li)即測定結果(guo)。

9． 在450nm波(bo)長處測(ce)定各(ge)孔的(de)OD值(zhi)。

人瘦(shou)素(su)試劑盒(he)性(xing)能

. 靈敏度：zui小(xiao)的檢(jian)測(ce)濃(nong)度小(xiao)於號(hao)標(biao)準(zhun)品(pin)。稀釋(shi)度的線(xian)性(xing)。樣品(pin)線(xian)性(xing)回(hui)歸(gui)與預期(qi)濃(nong)度相(xiang)關(guan)系數R值(zhi)為(wei)0.990。

2. 特(te)異性(xing)：不與其它細胞(bao)因(yin)子(zi)反(fan)應(ying)。

3. 重(zhong)復性(xing)：板(ban)內(nei)、板(ban)間變(bian)異系數均(jun)小(xiao)於0%。

結 果(guo) 判 斷(duan) 與 分(fen) 析

、儀器值(zhi)：於波(bo)長450nm的酶(mei)標儀(yi)上(shang)讀(du)取各(ge)孔的(de)OD值(zhi)

2、以(yi)吸光(guang)度OD值(zhi)為(wei)縱(zong)坐(zuo)標（Y），相(xiang)應(ying)的(de)Leptin標(biao)準(zhun)品(pin)濃(nong)度為橫坐(zuo)標（X），做得相(xiang)應(ying)的(de)曲線(xian)，樣(yang)品(pin)的Leptin含量可(ke)根(gen)據其OD值(zhi)由(you)標準(zhun)曲線(xian)換(huan)算出相(xiang)應(ying)的(de)濃(nong)度。

3、檢(jian)測(ce)值(zhi)範(fan)圍(wei)：0-40nmol/L

4、敏感(gan)度： 0. nmol/L