大鼠E-選擇(ze)素(su)（E-selectin）試(shi)劑(ji)盒操作(zuo)說明(ming)

大鼠E-選擇(ze)素(su)（E-selectin）試(shi)劑(ji)盒操作(zuo)說明(ming)

試驗(yan)原理：
大鼠E-選擇(ze)素(su)E-selectin試(shi)劑(ji)盒是固(gu)相夾(jia)心法(fa)酶聯免(mian)疫吸附實(shi)驗(yan)（ELISA）.已(yi)知E-selectin 濃度(du)的(de)標(biao)準品(pin)、未(wei)知濃度(du)的(de)樣品(pin)加(jia)入微孔酶標(biao)板(ban)內(nei)進行檢測(ce)。先將E-selectin 和(he)標(biao)記(ji)的(de)抗體(ti)同(tong)時溫(wen)育。洗滌(di)後(hou)，加入親和(he)素(su)標(biao)記(ji)過的(de)HRP。再經過溫育和洗滌(di)，去(qu)除未(wei)結(jie)合的(de)酶結(jie)合物，然後(hou)加入底(di)物A、B，和酶結(jie)合物同時作(zuo)用。產(chan)生顏(yan)色。顏(yan)色的(de)深(shen)淺和樣品(pin)中E-selectin 的(de)濃度(du)呈(cheng)比(bi)例關(guan)系(xi)。

操(cao)作(zuo)註(zhu)意事項(xiang)

．試(shi)劑(ji)應(ying)按(an)標(biao)簽說(shuo)明書儲(chu)存(cun)，使(shi)用前(qian)恢復到(dao)室(shi)溫。稀稀過後(hou)的(de)標(biao)準品(pin)應(ying)丟(diu)棄，不可保(bao)存(cun)。

2．實(shi)驗(yan)中不用(yong)的(de)板(ban)條應(ying)立(li)即(ji)放回(hui)包裝袋(dai)中，密封保(bao)存(cun)，以(yi)免(mian)變質(zhi)。

3．不用(yong)的(de)其它(ta)試(shi)劑(ji)應(ying)包裝好或蓋(gai)好。不同(tong)批(pi)號的(de)試劑(ji)不要(yao)混(hun)用。保(bao)質(zhi)前(qian)使(shi)用。

4．使(shi)用壹次性(xing)的(de)吸頭(tou)以(yi)免(mian)交叉汙染(ran)，吸取終(zhong)止液和(he)底(di)物A、B液時，避免(mian)使(shi)用帶(dai)金(jin)屬部分(fen)的(de)加樣器(qi)。

5．使(shi)用幹凈的(de)塑(su)料容(rong)器(qi)配置洗(xi)滌(di)液。使(shi)用前(qian)充分(fen)混(hun)勻(yun)試(shi)劑(ji)盒裏的(de)各(ge)種成份(fen)及(ji)樣品(pin)。

6．洗(xi)滌(di)酶標(biao)板(ban)時(shi)應(ying)充(chong)分(fen)拍幹，不要(yao)將(jiang)吸水紙直接(jie)放入酶標(biao)反(fan)應(ying)孔(kong)中吸水。

7．底(di)物A應(ying)揮(hui)發，避免(mian)長(chang)時(shi)間打開蓋子。底(di)物B對光敏感(gan)，避免(mian)長(chang)時(shi)間暴露(lu)於光(guang)下(xia)。避免(mian)用(yong)手(shou)接(jie)觸，有(you)毒。實(shi)驗(yan)完(wan)成後(hou)應(ying)立(li)即(ji)讀取OD值(zhi)。

8．加入試劑(ji)的(de)順序(xu)應(ying)壹致，以(yi)保(bao)證(zheng)所有反(fan)應(ying)板(ban)孔(kong)溫育的(de)時間壹樣。

9．按(an)照(zhao)說(shuo)明(ming)書中標(biao)明(ming)的(de)時間、加液(ye)的(de)量(liang)及(ji)順序(xu)進(jin)行溫育操作(zuo)。

樣品(pin)收集、處理及(ji)保(bao)存(cun)方(fang)法(fa)

、血清-----操作(zuo)過程(cheng)中避免(mian)任(ren)何(he)細(xi)胞(bao)刺激。使(shi)用不含(han)熱(re)原和(he)內(nei)毒素(su)的(de)試管。收集血液後(hou)，000×g離(li)心0分(fen)鐘(zhong)將(jiang)血清和紅細胞(bao)迅(xun)速(su)小心(xin)地分離(li)。

2、血漿(jiang)-----EDTA、檸(ning)檬酸鹽(yan)、肝素(su)血(xue)漿(jiang)可用於檢測(ce)。000×g離(li)心30分(fen)鐘(zhong)去(qu)除顆(ke)粒。

3、細胞(bao)上清液---000×g離(li)心0分(fen)鐘(zhong)去(qu)除顆(ke)粒和聚(ju)合物。

4、保(bao)存(cun)------大鼠E-選擇(ze)素(su)E-selectin如(ru)果(guo)樣品(pin)不立(li)即(ji)使(shi)用，應(ying)將(jiang)其(qi)分成(cheng)小(xiao)部分-70 ℃保(bao)存(cun)，避免(mian)反(fan)復冷凍(dong)。盡可能(neng)的(de)不要(yao)使(shi)用溶(rong)血(xue)或(huo)高(gao)血脂(zhi)血(xue)。如果血清中大量(liang)顆(ke)粒，檢測(ce)前(qian)先離(li)心或(huo)過濾。不要(yao)在(zai)37℃或更(geng)高(gao)的(de)溫度(du)加熱(re)解(jie)凍(dong)。應(ying)在(zai)室(shi)溫下(xia)解(jie)凍(dong)並確(que)保(bao)樣品(pin)均(jun)勻(yun)地充分解(jie)凍(dong)。

試劑(ji)的(de)準備

．標(biao)準品(pin)：標(biao)準品(pin)的(de)系(xi)列(lie)稀釋應(ying)在(zai)實(shi)驗(yan)時(shi)準備，不能(neng)儲(chu)存(cun)。稀釋前(qian)將標(biao)準品(pin)振(zhen)蕩(dang)混勻(yun)。稀釋比(bi)例按下表中進行：

400 ng/ml（6號標(biao)準品(pin)）原(yuan)倍濃度(du)不用(yong)稀釋直接(jie)加入50ul。

200 ng/ml（5號標(biao)準品(pin)）00ul的(de)原倍標(biao)準品(pin)加(jia)入00ul的(de)標(biao)準品(pin)稀釋液

00 ng/ml（4號標(biao)準品(pin)）00ul的(de)5號標(biao)準品(pin)加(jia)入00ul的(de)標(biao)準品(pin)稀釋液

50 ng/ml（3號標(biao)準品(pin)）00ul的(de)4號標(biao)準品(pin)加(jia)入00ul的(de)標(biao)準品(pin)稀釋液

25 ng/ml（2號標(biao)準品(pin)）00ul的(de)3號標(biao)準品(pin)加(jia)入00ul的(de)標(biao)準品(pin)稀釋液

2.5 ng/ml（號標(biao)準品(pin)）00ul的(de)2號標(biao)準品(pin)加(jia)入00ul的(de)標(biao)準品(pin)稀釋液

0 ng/ml（空(kong)白(bai)對照(zhao)）原(yuan)始濃度(du)不用(yong)稀釋直接(jie)加入50ul。

2．洗滌(di)緩沖(chong)液（20×）的(de)稀釋：蒸餾水(shui)20倍稀釋。

操作(zuo)步(bu)驟

．使(shi)用前(qian)，將所(suo)有(you)試(shi)劑(ji)充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)。不要(yao)使(shi)液體(ti)產(chan)生大量(liang)的(de)泡沫，以(yi)免(mian)加(jia)樣時(shi)加(jia)入大量(liang)的(de)氣(qi)泡，產(chan)生加(jia)樣上的(de)誤差(cha)。

2．根(gen)據(ju)待(dai)測(ce)樣品(pin)數(shu)量(liang)加上標(biao)準品(pin)的(de)數量(liang)決定(ding)所需(xu)的(de)板(ban)條數(shu)。每(mei)個(ge)標(biao)準品(pin)和(he)空(kong)白(bai)孔建(jian)議做復孔(kong)。每(mei)個(ge)樣品(pin)根(gen)據(ju)自己(ji)的(de)數量(liang)來定(ding)，能(neng)使(shi)用復孔(kong)的(de)盡量(liang)做復孔(kong)。

3．加(jia)入稀釋好後(hou)的(de)標(biao)準品(pin)50ul於反(fan)應(ying)孔(kong)、加(jia)入待(dai)測(ce)樣品(pin)50ul於反(fan)應(ying)孔(kong)內(nei)。立即(ji)加入50ul的(de)標(biao)記(ji)的(de)抗體(ti)。蓋(gai)上膜(mo)板(ban)，輕(qing)輕振蕩(dang)混勻(yun)，37℃溫(wen)育小時。

4．甩(shuai)去(qu)孔內(nei)液體(ti)，每(mei)孔加(jia)滿洗(xi)滌(di)液，振(zhen)蕩(dang)30秒，甩(shuai)去(qu)洗滌(di)液，用(yong)吸水紙拍幹。重復此(ci)操(cao)作(zuo)四(si)次。如(ru)果用洗板(ban)機洗滌(di)，洗滌(di)次數(shu)增加壹次。

5．每(mei)孔加入80ul的(de)親和(he)鏈(lian)酶素(su)-HRP，輕(qing)輕(qing)振(zhen)蕩(dang)混勻(yun)，37℃溫(wen)育30分鐘。

6．甩(shuai)去(qu)孔內(nei)液體(ti)，每(mei)孔加(jia)滿洗(xi)滌(di)液，振(zhen)蕩(dang)30秒，甩(shuai)去(qu)洗滌(di)液，用(yong)吸水紙拍幹。重復此(ci)操(cao)作(zuo)四(si)次。如(ru)果用洗板(ban)機洗滌(di)，洗滌(di)次數(shu)增加壹次。

7．每(mei)孔加入底(di)物A、B各(ge)50ul，輕(qing)輕振蕩(dang)混勻(yun)，37℃溫(wen)育5分鐘。避免(mian)光(guang)照(zhao)。

8．取(qu)出(chu)酶標(biao)板(ban)，迅(xun)速(su)加入50ul終(zhong)止液，加(jia)入終(zhong)止液後(hou)應(ying)立(li)即(ji)測(ce)定(ding)結(jie)果(guo)。

9．在(zai)450nm波長(chang)處(chu)測(ce)定(ding)各(ge)孔(kong)的(de)OD值(zhi)。

結(jie)果(guo)分(fen)析

大鼠E-選擇(ze)素(su)E-selectin以(yi)吸光度(du)OD值(zhi)為縱坐(zuo)標(biao)（Y），相(xiang)應(ying)的(de)E-selectin 標(biao)準品(pin)濃度(du)為橫(heng)坐(zuo)標(biao)（X），做(zuo)得相(xiang)應(ying)的(de)曲線(xian)，樣品(pin)的(de)E-selectin 含量(liang)可根(gen)據(ju)其OD值(zhi)由標(biao)準曲線(xian)換算(suan)出(chu)相應(ying)的(de)濃度(du)。

局限(xian)

6號標(biao)準品(pin)以(yi)上的(de)結(jie)果(guo)為(wei)非(fei)線(xian)性(xing)的(de)，根(gen)據(ju)此標(biao)準曲線(xian)無法(fa)得到的(de)結(jie)果(guo)。

試(shi)劑(ji)盒性(xing)能(neng)

．靈敏(min)度(du)：zui小的(de)檢測(ce)濃度(du)小於號標(biao)準品(pin)。稀釋度(du)的(de)線(xian)性(xing)。樣品(pin)線(xian)性(xing)回歸與預(yu)期濃度(du)相關(guan)系(xi)數(shu)R值(zhi)為0.990。

2．特(te)異(yi)性(xing)：不與(yu)人(ren)其(qi)它(ta)細(xi)胞(bao)因(yin)子反應(ying)。

3．重(zhong)復性(xing)：板(ban)內(nei)、板(ban)間變異(yi)系(xi)數(shu)均小於0%。