揭示蛋黃(huang)抗(kang)體的(de)研究(jiu)結(jie)果(guo)

揭示蛋黃(huang)抗(kang)體的(de)研究(jiu)結(jie)果(guo)

    高免蛋黃(huang)抗(kang)體具(ju)有過程簡單(dan)、效率高等特點(dian)，已(yi)越(yue)來(lai)越(yue)多地應(ying)用(yong)於人(ren)類(lei)許多疾(ji)病的預(yu)防和治療以及生物(wu)學的高度(du)特異(yi)性(xing)檢測(ce)等領(ling)域中(zhong)，並(bing)取(qu)得顯(xian)著成(cheng)效。本(ben)文(wen)主(zhu)要(yao)研究(jiu)了以(yi)人(ren)致病性(xing)大腸(chang)桿(gan)菌(jun)為(wei)抗(kang)原，免疫(yi)母(mu)雞，研究(jiu)獲(huo)得(de)含(han)有價(jia)蛋黃(huang)抗(kang)體的(de)雞蛋的(de)*條件；建(jian)立(li)快(kuai)速、準確(que)、定量(liang)的酶(mei)聯(lian)免疫(yi)吸附試驗(yan)（ELISA）測(ce)定(ding)蛋黃(huang)抗(kang)體（IgY）效價(jia)的技(ji)術(shu)；研究(jiu)抗(kang)人(ren)大(da)腸桿(gan)菌(jun)IgY分(fen)離(li)純(chun)化(hua)條(tiao)件及其(qi)理化(hua)、生化(hua)特性；研究(jiu)食(shi)品(pin)加(jia)工(gong)過程中(zhong)的各(ge)種(zhong)因素對(dui)大(da)腸桿(gan)菌(jun)特異(yi)IgY生物(wu)活性的(de)影響(xiang)；探討(tao)抗(kang)人(ren)大(da)腸桿(gan)菌(jun)免(mian)疫(yi)雞蛋抗(kang)體的(de)功(gong)能(neng)及(ji)其(qi)機(ji)理；評估(gu)蛋黃(huang)抗(kang)體的(de)安全性。

主(zhu)要(yao)獲得(de)如(ru)下結(jie)果(guo)：

    （） 對(dui)獲(huo)得含有價(jia)蛋黃(huang)抗(kang)體的(de)雞蛋的(de)*條件研究(jiu)發(fa)現(xian)：（a） 以大腸桿(gan)菌(jun)懸(xuan)浮液對(dui)20周(zhou)齡京白(bai)蛋雞免(mian)疫(yi)時，若(ruo)固(gu)定免(mian)疫(yi)抗(kang)原劑(ji)量(liang)為(wei)0.5ml，則(ze)當(dang)菌液濃(nong)度(du)低於(yu)×0~9 cfu／ml，免(mian)疫(yi)應(ying)答(da)強度(du)隨免(mian)疫(yi)劑(ji)量(liang)的(de)降(jiang)低而(er)降(jiang)低，當(dang)菌(jun)液濃(nong)度(du)高於×0~9 cfu／ml時，免疫(yi)應(ying)答(da)強度(du)不會(hui)隨免(mian)疫劑(ji)量(liang)的(de)增(zeng)加(jia)而得到(dao)明(ming)顯(xian)加(jia)強。因此，確(que)定(ding)*免(mian)疫劑(ji)量(liang)為(wei)每(mei)次(ci)0.5ml菌液濃(nong)度(du)為×0~9 cfu／ml的(de)大(da)腸(chang)桿(gan)菌(jun)懸(xuan)浮液。

    （b） 在大(da)腸桿(gan)菌(jun)懸(xuan)液中(zhong)添加(jia)等量(liang)的福氏(shi)*佐(zuo)劑(ji)、福氏(shi)不(bu)*佐(zuo)劑(ji)和白(bai)油(you)佐(zuo)劑(ji)能(neng)明(ming)顯(xian)加(jia)強免(mian)疫應(ying)答(da)強度(du)，其(qi)中(zhong)福氏(shi)*佐(zuo)劑(ji)對(dui)免(mian)疫應(ying)答(da)加強的(de)程度(du)zui高。

    （c） 胸部皮下註射、翅下皮下註射、大腿(tui)皮下註射、頸背(bei)皮下註射、胸部肌(ji)肉註射、翅下肌(ji)肉註射、大腿(tui)肌(ji)肉註射和頸背(bei)肌(ji)肉註射8種(zhong)不(bu)同(tong)免疫途(tu)徑對(dui)免(mian)疫應(ying)答(da)反應(ying)強度(du)沒有明(ming)顯(xian)影響(xiang)。

    （d） 強化(hua)免(mian)疫(yi)程序(xu)能(neng)大(da)大(da)加強產(chan)蛋母(mu)雞的(de)免(mian)疫應(ying)答(da)強度(du)，其(qi)中(zhong)初免(mian)後，每(mei)隔(ge)周強化(hua)免(mian)疫(yi)壹次(ci)，連(lian)續(xu)4次(ci)，此後每(mei)月(yue)僅(jin)用佐(zuo)劑(ji)抗(kang)原強化(hua)免(mian)疫(yi)次(ci)的強化(hua)免(mian)疫(yi)程序(xu)既經(jing)濟又有效。

    （2） 采取(qu)熱酚(fen)法(fa)提取(qu)E.coli LPS作(zuo)為(wei)抗(kang)原，以酶(mei)標(biao)記(ji)的(de)兔(tu)抗(kang)雞IgY抗(kang)抗(kang)體（IgG）為(wei)二抗(kang)建(jian)立(li)起(qi)來(lai)的(de)間(jian)接(jie)ELISA技(ji)術(shu)檢測(ce)特異(yi)蛋黃(huang)抗(kang)體IgY的(de)抗(kang)體效價(jia)，以酶(mei)標(biao)二(er)抗(kang)工(gong)作(zuo)濃(nong)度(du)為：2000，LPS抗(kang)原包(bao)被(bei)濃(nong)度(du)為：20（0ug／ml），可以檢測(ce)到(dao)雞特異(yi)IgY抗(kang)體效價(jia)為：0240。用(yong)豬源(yuan)EHEC和人(ren)源(yuan)沙(sha)門(men)氏(shi)菌(jun)的(de)LPS抗(kang)原進行(xing)了交叉檢測(ce)，表現(xian)出(chu)高度(du)的特異(yi)性(xing)。

    （3） 通過對(dui)蛋黃(huang)抗(kang)體（IgY）的(de)分(fen)離(li)純(chun)化(hua)條(tiao)件研究(jiu)發(fa)現(xian)，乙醇沈澱(dian)抗(kang)體的(de)*條件是粗提液：乙(yi)醇（V／V）為：0.35；經(jing)DEAE-Sephrose fast-flow離(li)子(zi)交換(huan)層析(xi)和Sephacryl S-200凝膠(jiao)排(pai)阻層析(xi)連(lian)續(xu)純(chun)化(hua)後可得到(dao)電(dian)泳純的(de)抗(kang)人(ren)大(da)腸桿(gan)菌(jun)IgY，其(qi)MW為(wei)86400Da（電(dian)泳法）或86500Da（凝(ning)膠(jiao)過濾法(fa)），該(gai)抗(kang)體由(you)兩個亞基構(gou)成(cheng)，分(fen)子(zi)質(zhi)量(liang)分(fen)別為(wei)65900Da和24600Da，其(qi)等電(dian)點(dian)為(wei)5.5。

    （4） 通過穩定(ding)性研究(jiu)發(fa)現(xian)： （a） 抗(kang)人(ren)大(da)腸桿(gan)菌(jun)IgY抗(kang)體在高溫下（≥75℃）容易發(fa)生熱變(bian)性(xing)，其(qi)熱變(bian)性(xing)的(de)反應(ying)級(ji)數為(wei).5，其(qi)熱變(bian)性(xing)溫(wen)度(du)點(dian)為(wei)75.0℃。

    （b）抗(kang)人(ren)大(da)腸桿(gan)菌(jun)抗(kang)體在酸(suan)性(xing)環(huan)境容(rong)易(yi)發(fa)生變(bian)性(xing)，而(er)在中(zhong)性和弱(ruo)堿性(xing)環(huan)境中(zhong)能(neng)較(jiao)好(hao)的(de)保(bao) 持(chi)穩定，其(qi)主(zhu)要(yao)變(bian)性(xing)發(fa)生在pH2.5壹3.0。

    （c）、和對(dui)抗(kang)人(ren)大(da)腸桿(gan)菌(jun)抗(kang)體的(de)活性保(bao)持(chi)均有不(bu)利的(de)作(zuo) 用(yong)，但發(fa)現(xian)，經上(shang)述3種(zhong)消(xiao)化(hua)道(dao)蛋白(bai)質(zhi)水解(jie)酶(mei)部分(fen)作(zuo)用(yong)後形(xing)成的(de)抗(kang)體水解(jie)物(wu)仍具(ju)有壹定的(de)抗(kang) 體活性。進壹步研究(jiu)確(que)定(ding)，在灌胃後lh內，小腸內抗(kang)體活性基(ji)本(ben)保(bao)持在zui高水平，而在Zh 之(zhi)後，抗(kang)體活性大(da)幅(fu)度(du)下降(jiang)，在灌胃後6h已(yi)經(jing)下降(jiang)到(dao)了非(fei)常低的(de)水平。

    （d）將抗(kang)人(ren)大(da)腸桿(gan)菌(jun)抗(kang)體貯(zhu)存在O℃和4℃是比較(jiao)合(he)適的，若貯(zhu)存在25℃以(yi)上(shang)的溫(wen)度(du)下， 抗(kang)體活性損失(shi)隨貯(zhu)存期(qi)的(de)延(yan)長而(er)不斷(duan)下降(jiang)。

    （e）加熱處(chu)理、蛋白(bai)酶(mei)處(chu)理以及(ji)冷凍幹(gan)燥處(chu)理對(dui)抗(kang)體的(de)活性都(dou)有不(bu)利的(de)影響(xiang)，但壹定濃(nong) 度(du)的乳(ru)糖、環(huan)糊(hu)精(jing)和糊精(jing)能(neng)加(jia)強抗(kang)體對(dui)熱處(chu)理和蛋白(bai)酶(mei)處(chu)理的穩(wen)定性(xing)，而(er)環(huan)糊(hu)精(jing)、乳(ru)糖、糊(hu) 精(jing)、果(guo)糖(tang)、葡(pu)萄(tao)糖、和甘油(you)都(dou)能(neng)不(bu)同(tong)程度(du)的加(jia)強抗(kang)體在冷(leng)凍幹(gan)燥過程中(zhong)的穩(wen)定性(xing)。

    （5）通過對(dui)抗(kang)人(ren)大(da)腸桿(gan)菌(jun)免(mian)疫(yi)蛋黃(huang)抗(kang)體的(de)功(gong)能(neng)及(ji)其(qi)機(ji)理探討(tao)發(fa)現(xian)，抗(kang)人(ren)人(ren)腸(chang)桿(gan)菌(jun)卵(luan)黃(huang)抗(kang)體 濃(nong)度(du)大於(yu)sm留ml，可對(dui)大(da)腸桿(gan)菌(jun)有明(ming)顯(xian)的(de)體(ti)外(wai)抑菌(jun)作(zuo)用(yong);抗(kang)人(ren)大(da)腸桿(gan)菌(jun)IgY對(dui)大(da)腸桿(gan)菌(jun)誘(you)導(dao) 的乳(ru)鼠腸(chang)道(dao)感(gan)染(ran)具(ju)有顯(xian)著的(de)預(yu)防和治療作(zuo)用(yong);抗(kang)人(ren)大(da)腸桿(gan)菌(jun)卵(luan)黃(huang)抗(kang)體可抑制大腸桿(gan)菌(jun)對(dui)腸(chang)上(shang) 皮細胞粘附作(zuo)用(yong)，隨著大腸(chang)桿(gan)菌(jun)濃(nong)度(du)的不(bu)斷(duan)升高，粘附率不斷(duan)增加，上(shang)皮細胞濃(nong)度(du)的增(zeng)加(jia)能(neng) 提高ETEC對(dui)其(qi)的(de)粘附率。

    （6）研究(jiu)發(fa)現(xian)，4.0 kGy的“。c。丫射線(xian)可使(shi)蛋中(zhong)可能(neng)汙染(ran)的(de)微(wei)生物(wu)全部滅活，而不(bu)影響(xiang) 抗(kang)體活性;雞抗(kang)人(ren)大(da)腸桿(gan)菌(jun)抗(kang)體對(dui)臨(lin)床檢查(zha)、血(xue)液學(xue)、生化(hua)學(xue)、器(qi)官重量、系數及(ji)組(zu)織(zhi)病(bing)理 學等指標(biao)無(wu)明(ming)顯(xian)影響(xiang)，證明(ming)雞蛋黃(huang)抗(kang)體IgY無(wu)急、‘漫(man)性毒(du)副作(zuo)用(yong):通過骨髓嗜(shi)染(ran)紅(hong)細(xi)胞(bao)微核 試驗(yan)、小鼠精(jing)子(zi)畸形(xing)試驗(yan)及(ji)Ames試驗(yan)，結(jie)果(guo)證(zheng)明(ming)雞抗(kang)人(ren)大(da)腸桿(gan)菌(jun)抗(kang)體無(wu)細胞(bao)毒(du)，無(wu)致突(tu)變(bian)作(zuo) 用(yong)。