大鼠中(zhong)性(xing)粒(li)細(xi)胞(bao)彈性(xing)蛋(dan)白(bai)酶(mei)（NE）試劑(ji)盒實驗(yan)分(fen)析(xi)

大(da)鼠中(zhong)性(xing)粒(li)細(xi)胞(bao)彈性(xing)蛋(dan)白(bai)酶(mei)（NE）試劑(ji)盒實驗(yan)分(fen)析(xi)

試驗原理(li)：
大鼠中(zhong)性(xing)粒(li)細(xi)胞(bao)彈性(xing)蛋(dan)白(bai)酶(mei)NE試劑(ji)盒是固(gu)相夾(jia)心法(fa)酶(mei)聯免(mian)疫吸附(fu)實驗(yan)（ELISA）.已知NE濃度的標(biao)準品(pin)、未(wei)知濃度的樣品(pin)加(jia)入微孔酶(mei)標(biao)板內進行(xing)檢測(ce)。先(xian)將(jiang)NE和(he)標(biao)記(ji)的(de)抗體(ti)同(tong)時溫(wen)育(yu)。洗滌(di)後(hou)，加(jia)入親和(he)素標(biao)記(ji)過(guo)的HRP。再(zai)經過溫育(yu)和(he)洗(xi)滌(di)，去除(chu)未(wei)結(jie)合(he)的(de)酶(mei)結(jie)合(he)物，然後(hou)加(jia)入底物A、B，和(he)酶(mei)結(jie)合(he)物同(tong)時作(zuo)用(yong)。產生(sheng)顏(yan)色。顏(yan)色的(de)深(shen)淺(qian)和(he)樣品(pin)中NE的濃度呈比例關(guan)系。

操(cao)作(zuo)註(zhu)意事(shi)項(xiang)

． 試劑(ji)應按(an)標(biao)簽說(shuo)明(ming)書(shu)儲存(cun)，使(shi)用(yong)前(qian)恢(hui)復(fu)到室(shi)溫(wen)。稀(xi)稀過後(hou)的標(biao)準品(pin)應丟棄，不可(ke)保存(cun)。

2． 實驗(yan)中不用(yong)的(de)板條(tiao)應(ying)立(li)即放回包(bao)裝袋(dai)中，密封(feng)保存(cun)，以免變(bian)質。

3． 不用(yong)的(de)其(qi)它(ta)試劑(ji)應包(bao)裝好(hao)或(huo)蓋(gai)好。不同(tong)批號的(de)試劑(ji)不要混(hun)用(yong)。保質前使(shi)用(yong)。

4． 使(shi)用(yong)壹次性(xing)的吸(xi)頭以(yi)免(mian)交叉(cha)汙(wu)染，吸(xi)取(qu)終止(zhi)液和(he)底(di)物A、B液(ye)時，避(bi)免使(shi)用(yong)帶(dai)金(jin)屬(shu)部(bu)分(fen)的(de)加(jia)樣器。

5． 使(shi)用(yong)幹凈的(de)塑料容(rong)器配置洗(xi)滌(di)液(ye)。使(shi)用(yong)前(qian)充分(fen)混(hun)勻(yun)試劑(ji)盒裏(li)的(de)各(ge)種(zhong)成份(fen)及(ji)樣品(pin)。

6． 洗滌(di)酶(mei)標(biao)板時應(ying)充分(fen)拍幹，不要將(jiang)吸水(shui)紙直(zhi)接放入(ru)酶(mei)標(biao)反應孔中(zhong)吸水(shui)。

7． 底(di)物A應(ying)揮(hui)發，避(bi)免長時間打開蓋(gai)子(zi)。底(di)物B對光(guang)敏(min)感(gan)，避免長(chang)時間暴露於光(guang)下。避(bi)免用(yong)手(shou)接觸，有毒(du)。實驗(yan)完成後(hou)應立即讀取(qu)OD值。

8． 加(jia)入試劑(ji)的順序應(ying)壹致，以保證(zheng)所(suo)有(you)反應板孔溫育(yu)的時間壹樣。

9． 按(an)照說(shuo)明(ming)書(shu)中(zhong)標(biao)明(ming)的(de)時間、加(jia)液的量(liang)及(ji)順序進(jin)行(xing)溫育(yu)操作(zuo)。

樣品(pin)收集、處(chu)理及(ji)保存(cun)方法(fa)

、 血(xue)清(qing)-----大鼠中(zhong)性(xing)粒(li)細(xi)胞(bao)彈性(xing)蛋(dan)白(bai)酶(mei)NE操(cao)作過程中(zhong)避(bi)免(mian)任(ren)何(he)細(xi)胞(bao)刺激(ji)。使(shi)用(yong)不含(han)熱(re)原和(he)內(nei)毒(du)素的(de)試管。收(shou)集(ji)血(xue)液(ye)後(hou)，000×g離心0分(fen)鐘(zhong)將(jiang)血(xue)清(qing)和(he)紅(hong)細(xi)胞(bao)迅(xun)速(su)小(xiao)心地(di)分(fen)離(li)。

2、 血(xue)漿(jiang)-----EDTA、檸檬酸(suan)鹽(yan)、肝素血(xue)漿(jiang)可用(yong)於(yu)檢測(ce)。000×g離(li)心30分(fen)鐘(zhong)去除(chu)顆粒(li)。

3、 細(xi)胞(bao)上(shang)清(qing)液---000×g離心0分(fen)鐘(zhong)去除(chu)顆粒(li)和(he)聚(ju)合(he)物。

4、 組(zu)織勻漿(jiang)-----將組(zu)織加(jia)入適量(liang)生(sheng)理(li)鹽(yan)水(shui)搗(dao)碎(sui)。000×g離(li)心0分(fen)鐘(zhong)，取(qu)上清(qing)液

5、 保存(cun)------如(ru)果樣品(pin)不立(li)即使(shi)用(yong)，應(ying)將(jiang)其(qi)分(fen)成小部分(fen)-70 ℃保存(cun)，避免反復(fu)冷(leng)凍(dong)。盡(jin)可能的(de)不要使(shi)用(yong)溶血(xue)或(huo)高(gao)血(xue)脂血(xue)。如(ru)果血(xue)清(qing)中大量(liang)顆粒(li)，檢測(ce)前(qian)先(xian)離(li)心或(huo)過(guo)濾。不要在37℃或(huo)更(geng)高(gao)的(de)溫(wen)度(du)加(jia)熱解凍(dong)。應在室(shi)溫(wen)下(xia)解凍(dong)並確(que)保樣品(pin)均勻地充分(fen)解凍(dong)。

試劑(ji)的準備

． 標(biao)準品(pin)：標(biao)準品(pin)的系列(lie)稀釋(shi)應在實驗(yan)時準備，不能(neng)儲存(cun)。稀釋前(qian)將(jiang)標(biao)準品(pin)振蕩(dang)混(hun)勻(yun)。稀(xi)釋(shi)比例按下表(biao)中(zhong)進(jin)行(xing)

2． 洗滌(di)緩(huan)沖液（50×）的稀(xi)釋：蒸(zheng)餾水(shui)50倍稀(xi)釋(shi)。

操(cao)作步(bu)驟

． 使(shi)用(yong)前(qian)，將(jiang)所(suo)有(you)試劑(ji)充分(fen)混(hun)勻(yun)。不要使(shi)液體(ti)產生(sheng)大(da)量(liang)的(de)泡(pao)沫(mo)，以免(mian)加(jia)樣時加(jia)入大量(liang)的(de)氣(qi)泡(pao)，產生(sheng)加(jia)樣上(shang)的誤差(cha)。

2． 根據(ju)待(dai)測(ce)樣品(pin)數量加(jia)上標(biao)準品(pin)的數量決(jue)定(ding)所(suo)需(xu)的板條(tiao)數。每個(ge)標(biao)準品(pin)和(he)空(kong)白(bai)孔建議做(zuo)復(fu)孔(kong)。每(mei)個(ge)樣品(pin)根據自己(ji)的數量來定(ding)，能(neng)使(shi)用(yong)復(fu)孔(kong)的(de)盡(jin)量做(zuo)復(fu)孔(kong)。標(biao)本(ben)用(yong)標(biao)本(ben)稀釋(shi)液：稀(xi)釋後(hou)加(jia)入50ul於反應孔內(nei)。

3． 加(jia)入稀釋(shi)好(hao)後(hou)的標(biao)準品(pin)50ul於反應孔、加(jia)入待(dai)測(ce)樣品(pin)50ul於反應孔內(nei)。立即加(jia)入50ul的標(biao)記(ji)的(de)抗體(ti)。蓋(gai)上(shang)膜(mo)板，輕輕振(zhen)蕩(dang)混(hun)勻(yun)，37℃溫(wen)育(yu)小時。

4． 甩去孔內液體(ti)，每(mei)孔(kong)加(jia)滿(man)洗滌(di)液(ye)，振蕩(dang)30秒(miao)，甩去洗滌(di)液(ye)，用(yong)吸(xi)水(shui)紙拍幹。重(zhong)復(fu)此(ci)操(cao)作(zuo)3次(ci)。如(ru)果用(yong)洗(xi)板機(ji)洗滌(di)，洗(xi)滌(di)次(ci)數增(zeng)加(jia)壹次。

5． 每(mei)孔加(jia)入80ul的親(qin)和(he)鏈酶(mei)素-HRP，輕(qing)輕(qing)振蕩(dang)混(hun)勻(yun)，37℃溫(wen)育(yu)30分(fen)鐘(zhong)。

6． 大(da)鼠中(zhong)性(xing)粒(li)細(xi)胞(bao)彈性(xing)蛋(dan)白(bai)酶(mei)NE甩去孔內液體(ti)，每(mei)孔(kong)加(jia)滿(man)洗滌(di)液(ye)，振蕩(dang)30秒(miao)，甩去洗滌(di)液(ye)，用(yong)吸(xi)水(shui)紙拍幹。重(zhong)復(fu)此(ci)操(cao)作(zuo)3次(ci)。如(ru)果用(yong)洗(xi)板機(ji)洗滌(di)，洗(xi)滌(di)次(ci)數增(zeng)加(jia)壹次。

7． 每(mei)孔加(jia)入底物A、B各(ge)50ul，輕(qing)輕(qing)振(zhen)蕩(dang)混(hun)勻(yun)，37℃溫(wen)育(yu)0分(fen)鐘(zhong)。避(bi)免(mian)光(guang)照。

8． 取(qu)出酶(mei)標(biao)板，迅(xun)速(su)加(jia)入50ul終止(zhi)液，加(jia)入終止(zhi)液後(hou)應立即測定(ding)結(jie)果(guo)。

9． 在450nm波(bo)長(chang)處(chu)測定(ding)各(ge)孔(kong)的(de)OD值(zhi)。

局(ju)限

6號標(biao)準品(pin)以上的結(jie)果(guo)為(wei)非(fei)線性的，根據(ju)此(ci)標(biao)準曲線無(wu)法(fa)得到的(de)結(jie)果(guo)。

試劑(ji)盒性(xing)能(neng)

. 靈敏(min)度(du)：zui小的檢測(ce)濃(nong)度(du)小(xiao)於(yu)號(hao)標(biao)準品(pin)。稀釋度的線性。樣品(pin)線性回歸(gui)與(yu)預(yu)期(qi)濃(nong)度相關(guan)系數R值為(wei)0.990。

2. 特(te)異(yi)性：不與(yu)其(qi)它(ta)細(xi)胞(bao)因(yin)子(zi)反應。

3. 重(zhong)復(fu)性(xing)：板內、板間變異(yi)系數均小(xiao)於0%。

結(jie)果(guo)判(pan)斷(duan)與(yu)分(fen)析(xi)

、儀器值：於(yu)波(bo)長(chang)450nm的酶(mei)標(biao)儀上讀(du)取(qu)各(ge)孔(kong)的(de)OD值(zhi)

2、以(yi)吸光(guang)度OD值(zhi)為縱坐標(biao)（Y），相(xiang)應(ying)的(de)NE標(biao)準品(pin)濃度為橫坐標(biao)（X），做(zuo)得相(xiang)應的曲線，樣品(pin)的NE含量可根據其(qi)OD值(zhi)由標(biao)準曲線換算(suan)出相(xiang)應的(de)濃度(du)。

3、檢測(ce)值(zhi)範(fan)圍(wei)：0-40ng/ml

4、敏(min)感(gan)度： 0. ng/ml