非(fei)標(biao)記抗體(ti)免疫(yi)電(dian)鏡(jing)操作方法

操作方法

．經典法

（）將被(bei)檢病毒材(cai)料0.9ml，加︰5～︰0稀釋(shi)的(de)特異(yi)性免疫(yi)血清(qing)0.ml充(chong)分混(hun)合(he)。

（2）置(zhi)37℃作用h或(huo)37℃h後再置(zhi)4℃過(guo)夜。ELISA試(shi)劑(ji)盒

（3）以7 000r/min～23 000r/min離(li)心(xin)90min。

（4）吸(xi)去(qu)上清(qing)，將離(li)心(xin)管口(kou)倒置(zhi)於(yu)濾(lv)紙上，吸(xi)去(qu)殘(can)留(liu)液體(ti)。

（5）沈澱物中(zhong)加少量(liang)H2O混懸，用3%磷(lin)鎢酸(suan)(pH6.0)負染(ran)20Sec～30Sec，滴(di)加於400目銅(tong)網(wang)Fomnvar膜(mo)上，用濾(lv)紙從銅網邊(bian)緣(yuan)輕(qing)輕(qing)吸去(qu)多余(yu)的(de)負染(ran)液。

（6）在透(tou)射電(dian)鏡(jing)下4×04倍觀(guan)察。

2．快速法(瓊脂擴散法)

（）同經典(dian)法()、(2)步驟，制(zhi)備(bei)免疫(yi)復合(he)物。ELISA試(shi)劑(ji)盒

（2）以生理(li)鹽水(shui)或(huo)pH 7.2緩(huan)沖(chong)液制(zhi)備(bei)%瓊脂糖(tang)，趁熱澆(jiao)註(zhu)於潔凈的(de)載(zai)玻(bo)片(pian)上，每(mei)片(pian)3ml，待冷卻凝固(gu)後，在凝(ning)膠(jiao)面(mian)上等距(ju)離(li)放(fang)置(zhi)直(zhi)徑(jing)4mm玻(bo)璃珠(zhu)數粒(li)，再於(yu)凝膠(jiao)面(mian)上澆(jiao)註(zhu)%瓊脂糖(tang)2ml～3ml，冷卻凝固(gu)後，取出(chu)玻(bo)璃珠(zhu)，使凝膠(jiao)形(xing)成凹(ao)孔。

（3）將普通濾(lv)紙剪成2×3cm大小(xiao)，3～4層(ceng)重(zhong)疊。用小(xiao)刀將(jiang)帶(dai)有(you)凹(ao)孔的(de)瓊脂糖(tang)切成小(xiao)塊,每塊帶(dai)有(you)壹(yi)個凹(ao)孔,平放(fang)在濾(lv)紙上。

（4）在(zai)凹(ao)孔內，加(jia)入制(zhi)備(bei)好的(de)含病毒的(de)免疫(yi)復合(he)物懸(xuan)液。

（5）將電(dian)鏡(jing)載(zai)網的(de)Fomnvar膜面(mian)向(xiang)下倒懸於液滴上。由(you)於(yu)瓊脂糖(tang)的(de)吸水(shui)作用，20min～30min後，可將液滴的(de)水(shui)分吸(xi)幹(gan)，而濃(nong)縮的(de)免疫(yi)復合(he)物則(ze)粘(zhan)附(fu)在(zai)載(zai)網膜(mo)上。

（6）在(zai)載(zai)網膜(mo)上滴(di)加3%磷(lin)鎢酸(suan)負染(ran)20Sec，過(guo)量(liang)的(de)負染(ran)液用濾(lv)紙在載(zai)網邊(bian)緣(yuan)輕(qing)輕(qing)吸去(qu)。

（7）於透(tou)射電(dian)鏡(jing)4×04倍下觀(guan)察。ELISA試(shi)劑(ji)盒

結果判定(ding)

直(zhi)接(jie)觀(guan)察病毒粒(li)子(zi)的(de)形(xing)態(tai)。由(you)於(yu)離(li)心(xin)濃(nong)縮的(de)處理(li)和特(te)異性(xing)抗體(ti)的(de)加入(ru)，大大提高(gao)了觀(guan)察的(de)敏感性。