免(mian)疫印(yin)跡的(de)檢查過(guo)程(cheng)

檢查過(guo)程(cheng)

() 蛋(dan)白質(zhi)樣品(pin)獲得：細菌誘導(dao)表達後，可(ke)通(tong)過(guo)電泳(yong)上樣(yang)緩(huan)沖液直接裂(lie)解(jie)細胞，真核(he)細(xi)胞(bao)加(jia)勻漿緩(huan)沖液，機(ji)械或超聲波室(shi)溫(wen)勻漿0.5-min。然(ran)後(hou)4℃，3,000g離(li)心5min。取(qu)上清液作(zuo)為樣(yang)品(pin)。

(2) 電泳(yong)：制備電泳(yong)凝膠(jiao)，進行(xing)SDS-PAGE。　

(3) 轉(zhuan)移(yi)：(半幹式轉(zhuan)移(yi))

① 電泳(yong)結束後將膠(jiao)條(tiao)割至(zhi)合適大(da)小，用(yong)轉膜(mo)緩(huan)沖液平衡，5min×3次(ci)。

② 膜(mo)處理(li)：預(yu)先裁(cai)好與膠(jiao)條(tiao)同(tong)樣(yang)大(da)小的(de)濾(lv)紙和NC膜(mo)，浸入(ru)轉(zhuan)膜(mo)緩(huan)沖液中0min。

③ 轉膜(mo)：轉膜(mo)裝置從(cong)下(xia)至(zhi)上依次(ci)按(an)陽極碳板(ban)、24層濾(lv)紙、NC膜(mo)、凝膠(jiao)、24層濾(lv)紙、陰極碳板(ban)的(de)順序放(fang)好(hao)，濾(lv)紙、凝膠(jiao)、NC膜(mo)對齊(qi)，每壹步去除(chu)氣泡(pao)，上(shang)壓500g重物，將(jiang)碳板(ban)上多余的(de)液體(ti)吸(xi)幹。接通(tong)電源(yuan),恒(heng)流(liu)mA/cm2，轉移(yi).5hr。轉移(yi)結束後，斷開(kai)電源(yuan)將膜(mo)取出(chu),割取(qu)待(dai)測膜(mo)條做(zuo)免(mian)疫印(yin)跡。將(jiang)有(you)蛋(dan)白標(biao)準(zhun)的(de)條帶(dai)染(ran)色(se)，放入(ru)膜(mo)染色(se)液中(zhong)50s後，在(zai)50%甲(jia)醇中多次(ci)脫色(se)，至背景(jing)清晰，然(ran)後用雙(shuang)蒸(zheng)水(shui)洗(xi)，風幹夾於兩層濾(lv)紙中保存，留與顯(xian)色(se)結果(guo)作(zuo)對比(bi)。

(4) 免(mian)疫反(fan)應：　

① 用0.0M PBS洗(xi)膜(mo)，5min ×3次(ci)。

② 加(jia)入(ru)包(bao)被液(ye)，平(ping)穩(wen)搖動(dong)，室(shi)溫(wen)2hr。　細胞(bao)

③ 棄包(bao)被液，用(yong)0.0M PBS洗(xi)膜(mo)，5min×3次(ci)。　

④ 加(jia)入(ru)壹(yi)抗(kang)(按(an)合適稀釋比例(li)用0.0M PBS稀(xi)釋，液(ye)體必須覆(fu)蓋(gai)膜(mo)的(de)全部)，4℃ 放置2hr以上。陰(yin)性對(dui)照(zhao)，以%BSA取代(dai)壹(yi)抗(kang)，其余(yu)步驟(zhou)與實(shi)驗組(zu)相同(tong)。　

⑤ 棄(qi)壹(yi)抗(kang)和%BSA，用0.0M PBS分別(bie)洗(xi)膜(mo)，5min×4次(ci)。　

⑥ 加(jia)入(ru)辣(la)根過氧(yang)化(hua)物(wu)酶偶(ou)聯的(de)二抗(kang)(按(an)合適稀釋比例(li)用0.0M PBS稀(xi)釋)，平(ping)穩(wen)搖動(dong)，室(shi)溫(wen)2hr。　

⑦ 棄二(er)抗(kang)，用0.0M PBS洗(xi)膜(mo)，5min×4次(ci)。　

8、加(jia)入(ru)顯(xian)色(se)液，避(bi)光顯(xian)色(se)至出(chu)現條(tiao)帶時放入(ru)雙(shuang)蒸(zheng)水(shui)中終(zhong)止反應。細胞(bao)