雙抗體夾心(xin)法(fa)與間(jian)接法(fa)

雙抗體夾心(xin)法(fa)：

() 包(bao)被(bei)：用(yong)0.05M PH9.牰碳(tan)酸(suan)鹽(yan)包(bao)被(bei)緩(huan)沖液將(jiang)抗體稀(xi)釋(shi)至(zhi)蛋(dan)白(bai)質含(han)量為～0μg/ml。在每個(ge)聚(ju)苯(ben)乙(yi)烯(xi)板(ban)的(de)反(fan)應孔中加0.ml，4℃過(guo)夜(ye)。次(ci)日，棄去(qu)孔內(nei)溶(rong)液，用(yong)洗(xi)滌緩沖液洗(xi)3次(ci)，每次3分(fen)鐘。(簡(jian)稱(cheng)洗(xi)滌，下同(tong))。

(2) 加(jia)樣：加(jia)壹(yi)定(ding)稀(xi)釋(shi)的(de)待(dai)檢(jian)樣品(pin)0.ml於(yu)上(shang)述已(yi)包(bao)被(bei)之反(fan)應孔中，置(zhi)37℃孵(fu)育小時(shi)。然(ran)後(hou)洗(xi)滌。(同(tong)時(shi)做(zuo)空(kong)白(bai)孔，陰性對照(zhao)孔(kong)及(ji)陽性對照(zhao)孔(kong))。

(3) 加(jia)酶標(biao)抗體：於(yu)各反(fan)應孔中，加入(ru)新(xin)鮮(xian)稀(xi)釋(shi)的(de)酶標(biao)抗體(經滴(di)定(ding)後的(de)稀(xi)釋(shi)度)0.ml。37℃孵(fu)育0.5～小時(shi)，洗(xi)滌。

(4) 加底物(wu)液顯色：於(yu)各反(fan)應孔中加入(ru)臨(lin)時(shi)配(pei)制的(de)TMB底物(wu)溶(rong)液0.ml，37℃0～30分(fen)鐘。

(5) 終(zhong)止反(fan)應：於(yu)各反(fan)應孔中加入(ru)2M硫酸(suan)0.05ml。

(6) 結果(guo)判定：可(ke)於(yu)白(bai)色背景上(shang)，直(zhi)接用肉(rou)眼(yan)觀(guan)察結果(guo)：反(fan)應孔內(nei)顏色(se)越深(shen)，陽性程度越強，陰(yin)性(xing)反(fan)應為無(wu)色(se)或(huo)極(ji)淺(qian)，依(yi)據所(suo)呈(cheng)顏色的(de)深(shen)淺(qian)，以“+"、“-"號表(biao)示(shi)。也可(ke)測O·D值(zhi)：在ELISA檢(jian)測儀上(shang)，於(yu)450nm(若(ruo)以ABTS顯色，則40nm)處，以空(kong)白(bai)對照(zhao)孔(kong)調(tiao)零後測(ce)各孔(kong)O·D值(zhi)，若大(da)於(yu)規(gui)定(ding)的(de)陰性(xing)對照(zhao)OD值(zhi)的(de)2.倍，即(ji)為陽性。

間(jian)接法(fa)：

    用(yong)包(bao)被(bei)緩(huan)沖液將(jiang)已(yi)知(zhi)抗原稀(xi)釋(shi)至(zhi)～0μg/ml，每(mei)孔加0.ml，4℃過(guo)夜(ye)。次(ci)日洗(xi)滌3次。加壹定(ding)稀(xi)釋(shi)的(de)待(dai)檢(jian)樣品(pin)(未知(zhi)抗體)0.ml於(yu)上(shang)述已(yi)包(bao)被(bei)之反(fan)應孔中,置(zhi)37℃孵(fu)育小時(shi),洗(xi)滌。(同(tong)時(shi)做(zuo)空(kong)白(bai)、陰性及(ji)陽性孔對照(zhao))於(yu)反(fan)應孔中，加入(ru)新(xin)鮮(xian)稀(xi)釋(shi)的(de)酶標(biao)第二抗體(抗抗體)0.ml，37℃孵(fu)育30-60分(fen)鐘，洗(xi)滌,zui後壹遍(bian)用DDW洗(xi)滌。其余步驟(zhou)同(tong)“雙抗體夾心(xin)法(fa)"的(de)4、5、6。