如(ru)何降(jiang)低ELISA的(de)背(bei)景(jing)

    ELISA實驗(yan)的(de)原(yuan)理(li)似(si)乎很(hen)簡單，不外(wai)乎固(gu)定抗原(yuan)，添(tian)加壹抗、二抗和(he)底(di)物，間中夾(jia)雜著洗滌和(he)封(feng)閉(bi)。然而(er)，即使(shi)是平淡無奇的(de)洗(xi)滌(di)和(he)封(feng)閉(bi)，如(ru)果(guo)做(zuo)得不太(tai)好(hao)，也有(you)可(ke)能(neng)毀(hui)了整個(ge)實驗(yan)。在(zai)實驗(yan)結束(shu)時，我們是否(fou)能(neng)獲得有(you)意義的(de)信(xin)息(xi)，ELISA試劑(ji)盒(he)這在(zai)很(hen)大程(cheng)度(du)上(shang)取決於結(jie)果(guo)的(de)信(xin)噪(zao)比。ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)背(bei)景(jing)噪(zao)音會影(ying)響您(nin)對結(jie)果(guo)的(de)判(pan)斷(duan)。

洗滌(di)很(hen)重(zhong)要

    洗(xi)滌步(bu)驟(zhou)看(kan)似(si)很(hen)無聊，其實很(hen)重(zhong)要，因(yin)為(wei)如果(guo)未(wei)結合(he)的(de)材料（如非(fei)特(te)異(yi)結合(he)的(de)抗體(ti)或(huo)檢測試(shi)劑）殘(can)留(liu)在(zai)微(wei)孔板中，那(na)麽它(ta)會增(zeng)加背(bei)景(jing)噪(zao)音。如有(you)必(bi)要，可(ke)增(zeng)加洗(xi)滌(di)液中的(de)鹽濃度(du)，這會阻止非特(te)異(yi)結合(he)反(fan)應(ying)。如果(guo)背(bei)景(jing)過高，而(er)您(nin)懷疑(yi)洗滌(di)不夠時，可(ke)以嘗試(shi)增(zeng)加洗(xi)滌(di)次(ci)數(shu)。

封(feng)閉(bi)更(geng)關鍵

    封(feng)閉(bi)液(ye)的(de)作用(yong)是讓不相關(guan)的(de)蛋(dan)白占(zhan)據(ju)微(wei)孔板中潛(qian)在(zai)的(de)結(jie)合(he)位(wei)點。這就(jiu)降(jiang)低了(le)可(ke)產(chan)生信(xin)號(hao)的(de)抗體(ti)非(fei)特(te)異(yi)結合(he)的(de)機(ji)會。您(nin)當然也希望(wang)抗體(ti)只與(yu)目(mu)的(de)蛋(dan)白結(jie)合(he)吧(ba)。如(ru)果(guo)您(nin)的(de)背(bei)景(jing)過高，懷疑(yi)封(feng)閉(bi)不充分(fen)，那(na)麽您(nin)可以嘗試(shi)使(shi)用(yong)更(geng)高濃度(du)的(de)封(feng)閉(bi)液(ye)，或適當延長封(feng)閉(bi)時間(jian)。

    如(ru)果(guo)您(nin)壹直(zhi)被背(bei)景(jing)問(wen)題所(suo)困擾(rao)，那(na)麽也許(xu)您(nin)該(gai)花(hua)些(xie)時間(jian)來(lai)優化(hua)封(feng)閉(bi)液(ye)。這可能(neng)需要時間(jian)，但(dan)也是值(zhi)得的(de)。目(mu)前(qian)主(zhu)要有(you)兩種類(lei)型的(de)封(feng)閉(bi)液(ye)：蛋白和(he)非(fei)離子(zi)型去汙劑(ji)。您(nin)使(shi)用(yong)的(de)類(lei)型(xing)須取決於多個(ge)因(yin)素(su)，包(bao)括(kuo)微(wei)孔板的(de)表(biao)面(mian)試劑(ji)、ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)吸附的(de)抗原(yuan)、您(nin)的(de)抗體(ti)和(he)檢(jian)測試劑。好(hao)的(de)封(feng)閉(bi)液(ye)應(ying)降(jiang)低非(fei)特(te)異(yi)性結(jie)合(he)，但(dan)它(ta)不應(ying)當與(yu)抗原(yuan)、抗體(ti)或(huo)檢測試(shi)劑發生相(xiang)互作用(yong)。

    ELISA實驗(yan)zui常用的(de)非(fei)離子(zi)型去汙劑(ji)是Tween-20。這種封(feng)閉(bi)液(ye)便宜(yi)、穩(wen)定，在(zai)去除(chu)洗滌(di)過程(cheng)中的(de)壹(yi)些(xie)非特(te)異(yi)結合(he)上(shang)很(hen)有用(yong)。但它(ta)們只在(zai)存(cun)在(zai)時起作用(yong)，ELISA試(shi)劑盒(he)因(yin)為(wei)很(hen)容易(yi)被洗(xi)掉(diao)。因(yin)此(ci)所(suo)有洗滌液中也必(bi)須添(tian)加封(feng)閉(bi)液(ye)。請勿使(shi)用(yong)高濃度(du)（正常濃度(du)為(wei)0.0-0.%），它(ta)會降(jiang)低特(te)異(yi)結合(he)，產(chan)生假陰性。另(ling)壹(yi)個(ge)選擇(ze)是使(shi)用(yong)蛋白和(he)非(fei)離子(zi)型去汙劑(ji)這兩種封(feng)閉(bi)液(ye)，後者可協(xie)助洗(xi)滌(di)過程(cheng)中的(de)封(feng)閉(bi)。

    蛋(dan)白封(feng)閉(bi)液(ye)則(ze)有(you)所(suo)不同，是*的(de)。它(ta)們與(yu)開(kai)放(fang)位點結(jie)合(he)並封(feng)閉(bi)，同時穩(wen)定與(yu)微(wei)孔板結合(he)的(de)抗原(yuan)分(fen)子。常用的(de)蛋(dan)白封(feng)閉(bi)液(ye)包(bao)括(kuo)牛血清白蛋(dan)白（BSA）、脫脂奶粉(fen)、正常血清和(he)魚(yu)明膠(jiao)。血清組分(fen)的(de)內在(zai)多樣性可(ke)使(shi)它(ta)有效攔(lan)截許(xu)多不同類型的(de)分(fen)子相(xiang)互作用(yong)。不過，它(ta)的(de)缺點在(zai)於能(neng)與(yu)Protein A和(he)IgG抗體(ti)相(xiang)互作用(yong)。解決這個(ge)問(wen)題的(de)壹(yi)種(zhong)方法(fa)是使(shi)用(yong)雞(ji)或(huo)魚的(de)正常血清。

抗體(ti)濃度(du)須(xu)優(you)化(hua)

    ELISA實驗(yan)我們通常會follow師(shi)兄(xiong)師(shi)姐留下(xia)來(lai)的(de)操(cao)作步(bu)驟(zhou)，ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)但是如果(guo)試(shi)劑(ji)稍(shao)有不同，則(ze)可(ke)能(neng)需要優(you)化(hua)抗體(ti)的(de)量(liang)。記(ji)住，非特(te)異(yi)的(de)抗體(ti)結(jie)合(he)會(hui)增(zeng)加背(bei)景(jing)。為(wei)了防止這壹點，切勿(wu)使(shi)用(yong)過多的(de)壹(yi)抗或二抗。

檢測試(shi)劑(ji)要適(shi)量

    另(ling)壹(yi)點也很(hen)顯而(er)易見：切勿(wu)使(shi)用(yong)過多的(de)檢(jian)測(ce)試劑(ji)。如(ru)果(guo)濃度(du)過高，或(huo)者未(wei)正確稀(xi)釋，則(ze)會(hui)導致(zhi)高背(bei)景(jing)。也不要顯(xian)色過度(du)，如(ru)有(you)必(bi)要，優(you)化(hua)壹下(xia)何(he)時應(ying)加入(ru)終(zhong)止液。