雙鏈(lian)DNA探(tan)針(zhen)的(de)合(he)成方(fang)法

實驗原理

     分(fen)子(zi)生物研(yan)究(jiu)中，zui常用(yong)的(de)探(tan)針即(ji)為(wei)雙鏈(lian)DNA探(tan)針(zhen)，它(ta)廣(guang)泛應(ying)用(yong)於轉基(ji)因植物(wu)拷(kao)貝數的(de)鑒(jian)定、臨床(chuang)診(zhen)斷(duan)等(deng)方(fang)面。雙鏈(lian)DNA探(tan)針(zhen)的(de)合(he)成方(fang)法主要(yao)有(you)下(xia)列兩種(zhong):切(qie)口(kou)平移(yi)法和(he)隨(sui)機引(yin)物合(he)成法。ELISA試(shi)劑盒(he)

    切(qie)口(kou)平移(yi)法（nick translation） 當雙鏈(lian)DNA分(fen)子(zi)的(de)壹條鏈(lian)上產(chan)生切(qie)口(kou)時,E.coli DNA聚合酶(mei)Ⅰ就可(ke)將核苷(gan)酸(suan)連(lian)接到切口(kou)的(de)3'羥(qiang)基(ji)末端(duan)。同(tong)時該酶(mei)具(ju)有從(cong)5'→3'的(de)核酸(suan)外(wai)切酶(mei)活性,能(neng)從(cong)切口(kou)的(de)5'端(duan)除(chu)去(qu)核苷(gan)酸(suan)。由(you)於在切(qie)去(qu)核苷(gan)酸(suan)的(de)同(tong)時又(you)在(zai)切(qie)口(kou)的(de)3'端(duan)補(bu)上核苷(gan)酸(suan),從(cong)而使切口(kou)沿(yan)著(zhe)DNA鏈(lian)移(yi)動,用(yong)放射(she)性核苷(gan)酸(suan)代替(ti)原先無(wu)放射(she)性的(de)核苷(gan)酸(suan)，將(jiang)放射(she)性同(tong)位(wei)素(su)摻入到合成(cheng)新鏈(lian)中。zui合適(shi)的(de)切(qie)口(kou)平移(yi)片段(duan)壹般(ban)為(wei)50-500個(ge)核苷(gan)酸(suan)。切(qie)口(kou)平移(yi)反(fan)應受(shou)幾種(zhong)因(yin)素(su)的(de)影(ying)響: （a） 產(chan)物的(de)比(bi)活性取決於[α-32P]dNTP的(de)比(bi)活性和模板中核苷(gan)酸(suan)被(bei)置(zhi)換(huan)的(de)程(cheng)度。（b） DNA酶的(de)用(yong)量和E.coli DNA聚合酶(mei)Ⅰ的(de)質量會(hui)影響(xiang)產(chan)物片(pian)段(duan)的(de)大(da)小。（c） DNA模板中的(de)抑(yi)制物如瓊(qiong)脂(zhi)糖會(hui)抑制(zhi)酶(mei)的(de)活性, 故應使用(yong)仔細純(chun)化(hua)後的(de)DNA。

實驗試(shi)劑

（） 0×切(qie)口(kou)平移(yi)緩(huan)沖(chong)液(ye):  0.5M/L Tris-Cl （pH7.2）；  0.M/L MgSO4； 0mM/L DTT；  00ug/ml BSA。

（2） 未(wei)標記的(de)dNTP原液(ye)：除(chu)同(tong)位(wei)素(su)標記的(de)脫氧三(san)磷酸(suan)核苷(gan)酸(suan)外(wai),其(qi)余(yu)3種分(fen)別(bie)溶(rong)解於50mM/L Tris·Cl （pH7.5）溶(rong)液(ye)中,濃度為(wei)0.3mM/L。ELISA試(shi)劑盒(he)

（3） [α-32P] dCTP或(huo)[α-32P]dATP:400 Ci/mM, 0uCi/ul。

（4）E.coli DNA聚合酶(mei)Ⅰ：（4單位(wei)/ul）：溶(rong)於50ug/ml BSA, mM/L DTT, 50%甘油(you)，50mM/L Tris·Cl（pH7.5）中。

（5） DNA酶:mg/ml。

（6） EDTA :200mM/L （pH8.0）。

（7） 0M/L NH4Ac。

實驗步(bu)驟(zhou)

（） 按(an)下(xia)列配(pei)比(bi)混合(he):未(wei)標記的(de)dNTP 0ul   0×切(qie)口(kou)平移(yi)緩(huan)沖(chong)液(ye) 5ul    待(dai)標記的(de)DNA ug

[α-32 P]dCTP或(huo)dATP（70uCi） 7ul    E.coli DNA聚合酶(mei) 4單位(wei)    DAN酶(mei) I ul

加水至終(zhong)體(ti)積(ji) 50ul

 （2） 置於5℃水浴60分(fen)鐘(zhong)。

 （3） 加入5ul EDTA終(zhong)止(zhi)反(fan)應。

 （4） 反(fan)應液(ye)中加入(ru)醋(cu)酸(suan)銨(an),使終(zhong)濃度為(wei)0.5M/L, 加(jia)入(ru)兩倍體(ti)積(ji)預(yu)冷無(wu)水乙醇沈(chen)澱回收DNA探(tan)針(zhen)。

註意(yi)事(shi)項

、3H，32P及35S標記的(de)dNTP都(dou)可(ke)使用(yong)於探針(zhen)標記，但(dan)通(tong)常使用(yong)[α-32 P]-dNTP。

2、DNA酶(mei)Ⅰ的(de)活性不同(tong)，所得(de)到的(de)探(tan)針比(bi)活性也不同(tong)，DNA酶(mei)Ⅰ活性高，則(ze)所得(de)探針比(bi)活性高，但(dan)長(chang)度比(bi)較短。ELISA試(shi)劑盒(he)