四(si)噻唑藍(lan)實(shi)驗(yan)方法

    四(si)噻唑藍(lan)(methylthiazoletetrazolium，MTT)法(fa)被廣(guang)泛(fan)應(ying)用(yong)於細胞(bao)增(zeng)殖(zhi)和細胞(bao)毒(du)性(xing)的檢測(ce)。MTT為(wei)黃(huang)色化(hua)合物，可被(bei)活(huo)細胞(bao)線(xian)粒(li)體(ti)內(nei)的脫氫(qing)酶(mei)還原(yuan)生成(cheng)不(bu)溶於水的藍紫(zi)色結(jie)晶(jing)甲(jia)臌(formazan)，後者(zhe)沈積(ji)在(zai)細胞(bao)中(zhong)，而死亡細胞(bao)則無此酶(mei)活(huo)性而無此過程(cheng)。在(zai)壹定細胞(bao)敷(fu)範圍(wei)內(nei)甲(jia)躦(zuan)結(jie)晶(jing)的形成(cheng)量(liang)與(yu)活(huo)細胞(bao)數(shu)成(cheng)正(zheng)比。生(sheng)成的結晶(jing)產(chan)物可被(bei)二甲(jia)基(ji)亞(ya)碸(DMSO)溶解(jie)(也(ye)可以(yi)用(yong)含(han)50％的N，N壹二甲(jia)基(ji)甲(jia)酰胺(an)和20％的pH 4．7的十二甲(jia)基(ji)磺(huang)酸鈉的MTT溶解(jie)液溶(rong)解(jie))，利用(yong)酶標儀(yi)測定490 nm處的光(guang)密(mi)度OD值(zhi)，以(yi)反(fan)映出(chu)活(huo)細胞(bao)數(shu)目(mu)。

(壹(yi))材料

．待測細胞(bao)：96孔(kong)培(pei)養(yang)板培(pei)養(yang)24~72h的成層(ceng)細胞(bao)。(按(an)04／200μl／孔(kong)接(jie)種細胞(bao))。

2．MTT溶(rong)液(ye)：5mgMTT溶於lml培(pei)養(yang)液(與(yu)所用的培(pei)養(yang)細胞(bao)液(ye)相(xiang)同，不(bu)含(han)酚紅(hong))、

3．0mol／L PBS(pH7．2)或生(sheng)理鹽(yan)水(shui)中(zhong)。0．2μm濾膜(mo)除(chu)菌(jun)後，分裝(zhuang)，4℃保(bao)存(cun)，兩(liang)周內有效(xiao)。凍(dong)存(cun)可保(bao)存(cun)更長(chang)時間。使(shi)用時可配(pei)成(cheng)2mg／ml濃(nong)度。MTT粉(fen)末和溶液(ye)均(jun)需避光(guang)保(bao)存(cun)。

3．DMSO(分析(xi)純)。

4．96孔(kong)培(pei)養(yang)板，可調(tiao)移液(ye)器，吸管(guan)，離(li)心管(guan)。

5．CO2孵箱(xiang)，顯微鏡(jing)，微(wei)型振(zhen)蕩(dang)器，酶標儀(yi)。

(二)方法

．棄去(qu)細胞(bao)培(pei)養(yang)板中(zhong)培(pei)養(yang)液。

2．每孔(kong)中(zhong)加入50μl(2 mg／ml)MTT溶液(ye)，繼(ji)續(xu)培(pei)養(yang)3～4h。

3．終止(zhi)培(pei)養(yang)，小心吸(xi)棄(或倒置(zhi)培(pei)養(yang)板)孔(kong)內培(pei)養(yang)上(shang)清液，如(ru)為(wei)懸(xuan)浮細胞(bao)離(li)心後吸(xi)棄上(shang)清液。每孔(kong)加入50μl DMSO，在(zai)微型振(zhen)蕩(dang)器上(shang)震蕩(dang)5~0min，使(shi)結晶(jing)充(chong)分溶(rong)解(jie)。

4．比色：選(xuan)擇(ze)490nm波(bo)長(chang)，在(zai)酶標儀(yi)上(shang)測定各(ge)孔(kong)光(guang)吸(xi)收值(OD值)，記錄(lu)結(jie)果(guo)。

(三(san))結(jie)果分析(xi)

    細胞(bao)存(cun)活(huo)率=實(shi)驗(yan)組吸(xi)光(guang)度值(zhi)÷對(dui)照組吸(xi)光(guang)度值(zhi)×00％。如(ru)果是藥物試(shi)驗(yan)，以藥(yao)物濃(nong)度為(wei)橫坐(zuo)標，吸(xi)光(guang)度值(zhi)為(wei)縱(zong)坐(zuo)標繪制(zhi)率曲(qu)線(xian)。

    繪制(zhi)生長(chang)曲線(xian)：以(yi)時間為(wei)橫坐(zuo)標，吸(xi)光(guang)值(zhi)為(wei)縱(zong)坐(zuo)標繪制(zhi)細胞(bao)的生長(chang)曲線(xian)。

(四(si))註意(yi)事(shi)項(xiang)

．選擇(ze)合適的細胞(bao)濃(nong)度，培(pei)養(yang)終止(zhi)時(shi)細胞(bao)密(mi)度不(bu)宜(yi)過大，這樣(yang)才(cai)能保(bao)證MTT結晶(jing)形成(cheng)的量(liang)與(yu)細胞(bao)數(shu)呈良好(hao)的線性(xing)關(guan)系(xi)。

2．避(bi)免高(gao)濃(nong)度的血(xue)清物質影(ying)響實(shi)驗(yan)孔(kong)的光(guang)吸(xi)收值，壹般(ban)選低(di)於0％胎(tai)牛血(xue)清的培(pei)養(yang)液進行(xing)實(shi)驗(yan)。

3．設空(kong)白對照。與(yu)實(shi)驗(yan)孔(kong)平行(xing)設不(bu)加細胞(bao)只加培(pei)養(yang)液的空(kong)白對照孔(kong)，其(qi)他(ta)試驗(yan)條件(jian)保(bao)持壹致(zhi)，比色時(shi)，以(yi)空(kong)白對照孔(kong)調零(ling)。