原(yuan)生質體融合(he)的影(ying)響因(yin)素

()原生質體融合(he)的影(ying)響因(yin)素

①融(rong)合(he)劑(ji) 融合(he)劑(ji)有化(hua)學融(rong)合(he)劑(ji)和(he)物(wu)理融合(he)劑(ji)。

    現在(zai)普遍(bian)采(cai)用(yong)的(de)化(hua)學融(rong)合(he)手(shou)段(duan)是(shi)聚(ju)乙二醇(chun)(PEG)介導的化(hua)學融(rong)合(he)法(fa)。PEG以分(fen)子(zi)橋的形(xing)式在(zai)相(xiang)鄰原生質體膜(mo)間起中(zhong)介作(zuo)用(yong)．改(gai)變(bian)原(yuan)生質膜(mo)的流(liu)動性能，降(jiang)低(di)原(yuan)生質膜(mo)表面(mian)勢(shi)能，使(shi)膜(mo)中(zhong)的蛋(dan)白(bai)顆粒(li)凝(ning)集，形成(cheng)壹層易(yi)於(yu)融合(he)的無(wu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)顆粒(li)的(de)磷(lin)脂雙分子層(ceng)。在(zai)Ca 2+存(cun)在(zai)下，引起細(xi)胞膜(mo)表面(mian)的電(dian)子分(fen)布的(de)改(gai)變(bian)，從(cong)而使(shi)接觸(chu)處(chu)的質(zhi)膜(mo)形成(cheng)局(ju)部融合(he)．出現(xian)凹陷，形成(cheng)原(yuan)生質體橋，成(cheng)為細(xi)胞間通(tong)道並(bing)逐漸擴(kuo)大(da)，直(zhi)到(dao)兩個(ge)原(yuan)生質體全部融合(he)。PEG的分(fen)子量可(ke)分為幾種，適用(yong)的(de)相(xiang)對(dui)分(fen)子質量為000～6000，不同(tong)種類(lei)微(wei)生物(wu)對(dui)PEG分(fen)子量的要求不同(tong)。PEG的(de)用(yong)量(liang)為30％～50％，但隨微(wei)生物(wu)種類(lei)不同(tong)而異(yi)。

    原生質體融合(he)中(zhong)常(chang)用(yong)的(de)物(wu)理融合(he)劑(ji)有電(dian)場和(he)激光。電(dian)場融合(he)的原(yuan)理是利(li)用(yong)電(dian)場的作(zuo)用(yong)使(shi)原生質膜(mo)穿孔(kong)導致(zhi)原生質體融合(he)。電(dian)融合(he)過(guo)程中(zhong)電(dian)脈沖(chong)幅(fu)度(du)、寬(kuan)度(du)、波數和(he)個(ge)數等因(yin)素對(dui)質(zhi)膜(mo)通透(tou)性變(bian)化(hua)都有較(jiao)大(da)影(ying)響(xiang)。電(dian)融合(he)頻(pin)率可(ke)比PEG法(fa)高十倍以(yi)上。激光融(rong)合(he)是讓(rang)原(yuan)生質體先(xian)粘(zhan)在(zai)壹起，再用(yong)高峰值(zhi)功率密度(du)激光對(dui)接觸(chu)處(chu)進行(xing)照射(she)，使(shi)質膜(mo)被擊穿或(huo)產(chan)生微(wei)米(mi)級(ji)的(de)微(wei)孔(kong)。激光融(rong)合(he)的優點(dian)是毒(du)性小(xiao)、損(sun)傷小(xiao)、定(ding)位(wei)強(qiang)。

②無機(ji)離(li)子PEG介導融合(he)需要適(shi)量的(de)Ca 2+ 、Mg 2+和(he)壹定的(de)pH條(tiao)件。在(zai)電(dian)場融合(he)時(shi)．混(hun)合(he)液中(zhong)離(li)子的存(cun)在(zai)對(dui)電(dian)場及(ji)原生質體偶極(ji)化(hua)形成(cheng)偶極(ji)子有壹定的(de)影(ying)響，會(hui)幹擾(rao)融合(he)．因(yin)此(ci)，在(zai)電(dian)融合(he)中(zhong)壹般采(cai)用(yong)糖(tang)或(huo)糖(tang)醇(chun)為穩(wen)定(ding)劑(ji)，盡(jin)量(liang)減少(shao)無機(ji)離(li)子。

③溫度(du) 溫度(du)對(dui)原(yuan)生質體融合(he)頻(pin)率有(you)壹定的(de)影(ying)響，壹般在(zai)20～30 C下處(chu)理～0min。

④親株的親緣(yuan)關(guan)系(xi) 雖然原生質體融合(he)可(ke)以超(chao)越(yue)性(xing)障(zhang)礙(ai)，但進行(xing)原生質體融合(he)時(shi)是(shi)選擇(ze)親緣(yuan)關(guan)系(xi)比較(jiao)近(jin)的親株。因(yin)為遠(yuan)緣(yuan)親株融合(he)時(shi)染(ran)色體交換後的重(zhong)組(zu)體不穩(wen)定(ding)，易(yi)分(fen)離(li)，會(hui)影響(xiang)原生質體融合(he)的效(xiao)果(guo)。

⑤原(yuan)生質體的活性 原(yuan)生質體的活性對(dui)原(yuan)生質體融合(he)有很(hen)大(da)的(de)影(ying)響(xiang)，因(yin)此(ci)要制(zhi)備高活性的(de)原生質體。

⑥細(xi)胞密(mi)度(du)兩個(ge)親株進行(xing)原生質體融合(he)時(shi)，需(xu)要壹定的(de)細(xi)胞密(mi)度(du)．壹般原(yuan)生質體的濃度(du)要達(da)到07～08個／mL，這樣(yang)有助(zhu)於(yu)提高融合(he)頻(pin)率。

(2)融(rong)合(he)體的再生 融合(he)原生質體的再生包括(kuo)融合(he)體細(xi)胞壁(bi)和(he)融(rong)合(he)體的再生。細(xi)胞壁(bi)的重(zhong)建只是原(yuan)生質體再生過(guo)程中(zhong)的壹步，當(dang)完成(cheng)原(yuan)生質體再生後，進而發育(yu)形成(cheng)菌(jun)落，整(zheng)個過(guo)程稱(cheng)為復原(yuan)。復原(yuan)不(bu)僅是指原生質體本(ben)身(shen)長(chang)出(chu)細(xi)胞壁(bi)，而且還能從(cong)原(yuan)生質體細(xi)胞上(shang)長出(chu)有細(xi)胞壁(bi)的菌(jun)絲體。原生質體的復原(yuan)是(shi)壹個十分復雜(za)的生物(wu)學過(guo)程，其(qi)中(zhong)包括(kuo)細(xi)胞本(ben)身(shen)的(de)調(tiao)節和(he)修復。

(3)融(rong)合(he)體檢出和(he)鑒別方(fang)法(fa)

①直(zhi)接法(fa)原生質體融合(he)後直(zhi)接分離(li)到MM或(huo)SM上(shang)，即(ji)可(ke)直(zhi)接檢出(chu)融合(he)細(xi)胞。其(qi)優點(dian)是只需壹步就(jiu)可(ke)得到(dao)重(zhong)組(zu)體，且大(da)多數重(zhong)組(zu)體是穩(wen)定(ding)的(de)。缺點(dian)是難(nan)以檢(jian)出(chu)那(na)些表型延(yan)遲而基因(yin)已重(zhong)組的(de)融(rong)合(he)體。

②間接法(fa)把(ba)融(rong)合(he)產物(wu)先(xian)分(fen)離(li)到CM上，使(shi)原生質體再生．融合(he)和(he)非(fei)融(rong)合(he)的原(yuan)生質體都能生長，再分離(li)到SM上。其優點(dian)是能促使(shi)細(xi)胞壁(bi)更(geng)好地(di)再生．表型延(yan)遲重(zhong)組體容(rong)易檢(jian)出。缺點(dian)是需要兩步才能檢(jian)出(chu)重組(zu)體，需要相(xiang)當(dang)大(da)人(ren)力(li)和(he)物(wu)力(li)，而且得到的(de)重組(zu)體不太穩(wen)定(ding)。

    直(zhi)接法(fa)和(he)間接法(fa)都要用(yong)營(ying)養缺陷型標記，所得(de)重(zhong)組體不壹定能提(ti)高目(mu)標產物(wu)產量。

③鈍(dun)化(hua)選擇法(fa)鈍(dun)化(hua)選擇法(fa)是指(zhi)滅(mie)活原生質體和(he)具(ju)活性原(yuan)生質體融合(he)。把(ba)親本(ben)中(zhong)的壹方(野(ye)生型)原(yuan)生質體在(zai)50℃熱(re)處(chu)理2～3h，使(shi)融合(he)前原(yuan)生質體代謝途(tu)徑(jing)中(zhong)的某些酶(mei)鈍(dun)化(hua)而不能再生．再與另壹方(雙缺陷型)原(yuan)生質體融合(he)，並(bing)分離(li)到MM上。滅(mie)活除(chu)用(yong)加(jia)熱(re)方(fang)法(fa)外。還可(ke)用(yong)紫(zi)外(wai)線(xian)照射(she)或(huo)藥(yao)物(wu)處(chu)理。

    總之，原(yuan)生質體融合(he)作(zuo)為發展迅速(su)的壹項育(yu)種技(ji)術(shu)，具有(you)*的*性，主要表現(xian)在(zai)以(yi)下幾(ji)個方(fang)面(mian)：①原(yuan)生質體融合(he)可(ke)以提(ti)高重組(zu)頻(pin)率；②用(yong)於(yu)原生質體融合(he)的雙親可(ke)以少(shao)帶標記或(huo)不(bu)帶標記；③通過(guo)雙親或(huo)多親本(ben)的(de)原(yuan)生質體融合(he)，使(shi)遺(yi)傳(chuan)物(wu)質的交(jiao)換(huan)、傳遞更(geng)完整(zheng)，易(yi)形(xing)成(cheng)穩(wen)定(ding)的(de)二(er)倍體；④原生質體融合(he)沒有嚴格(ge)的受(shou)體與供體之分(fen)，是壹種超越(yue)性(xing)障(zhang)礙(ai)的育(yu)種方法(fa)，受(shou)接合(he)型和(he)致(zhi)育(yu)型限(xian)制小(xiao)，有(you)利(li)於(yu)不同(tong)種間、屬(shu)間微(wei)生物(wu)的雜(za)交；⑤利用(yong)原(yuan)生質體融合(he)．實(shi)現(xian)多親融合(he)．使(shi)各親本(ben)的(de)整(zheng)套(tao)染(ran)色體及(ji)核外(wai)遺(yi)傳(chuan)物(wu)質集中(zhong)到壹體，有可(ke)能增加(jia)控(kong)制(zhi)代(dai)謝產(chan)物(wu)產量的(de)結構基因(yin)的拷貝數．從(cong)而提高目(mu)標產物(wu)產量。

    原(yuan)生質體融合(he)與誘(you)變相結合(he)，有可(ke)能實(shi)現(xian)增產(chan)和(he)加(jia)速(su)育(yu)種進度(du)的(de)目(mu)的(de)。如把(ba)兩親株分別進行(xing)數次(ci)誘變(bian)處(chu)理，然而進行(xing)原生質體融合(he)，使(shi)相互(hu)間遺(yi)傳(chuan)物(wu)質進行(xing)充(chong)分交(jiao)換，從(cong)中(zhong)有可(ke)能篩(shai)選(xuan)到由(you)各次(ci)誘變(bian)累(lei)積(ji)的能有(you)效(xiao)提(ti)高目(mu)標產物(wu)產量的(de)突(tu)變基(ji)因(yin)功能都(dou)能充(chong)分發(fa)揮出來的(de)重(zhong)組體。