實(shi)體(ti)組織(zhi)材料的(de)分(fen)離方法(fa)

實(shi)體(ti)組織(zhi)材料的(de)分(fen)離方法(fa)

    對(dui)於實(shi)體(ti)組織(zhi)材料，細胞(bao)間結合緊密，可采(cai)用機(ji)械(xie)分(fen)散法(fa)和(he)消化(hua)分(fen)離法(fa)使(shi)組織(zhi)中的(de)細胞(bao)寬分(fen)分(fen)散，形(xing)成細胞(bao)懸(xuan)液(ye)。

(壹)機(ji)械(xie)分(fen)散法(fa)

    機(ji)械(xie)分(fen)散法(fa)，指(zhi)通(tong)過(guo)各(ge)種(zhong)各(ge)樣的(de)物理(li)學(xue)處理(li)手段，將(jiang)所取(qu)得(de)動(dong)物組織(zhi)解離成為單個(ge)細胞(bao)藥方法(fa)，包(bao)括切割分(fen)離法(fa)和(he)機(ji)械(xie)分(fen)散法(fa)。

．材(cai)料

()標(biao)本：各(ge)類實(shi)體(ti)組織(zhi)材料。

(2)試劑：Hanks液(ye)、培(pei)養液(ye)。

(3)器(qi)具：手術(shu)刀(dao)、眼科剪、不(bu)銹(xiu)鋼(gang)(rg龍)的(de)篩網(wang)、平(ping)皿(min)、三(san)角(jiao)燒瓶(ping)。

2．機(ji)械(xie)分(fen)散的(de)操作步(bu)驟

()切割分(fen)離法(fa)：無(wu)菌切取cm3壹塊組織(zhi)，置人(ren)小(xiao)燒杯(bei)中(zhong)，左(zuo)手斜持(chi)容器(qi)，右(you)手持(chi)長(chang)柄眼科剪伸入容器(qi)中(zhong)，反復剪切組織(zhi)至lmm3大(da)小(xiao)，用吸管(guan)吸(xi)取(qu)Hanks液(ye)把附(fu)著(zhe)在(zai)剪刀(dao)上(shang)的(de)組織(zhi)小(xiao)塊沖下。並(bing)再補充(chong)適(shi)量的(de)Hanks液(ye)後，用吸管(guan)反(fan)復(fu)輕柔吹(chui)打片刻(ke)，低(di)速(su)離心(xin)，棄上清(qing)液(ye)，余下的(de)組織(zhi)塊可用於細胞(bao)培(pei)養。

(2)機(ji)械(xie)分(fen)散法(fa)：所取(qu)標(biao)本是(shi)纖(xian)維成分(fen)很少(shao)的(de)軟組織(zhi)，如腦(nao)組織(zhi)，部分(fen)胚胎(tai)組(zu)織(zhi)及壹些腫(zhong)瘤組織(zhi)。將(jiang)組織(zhi)塊處理(li)成小(xiao)塊後，可將(jiang)組織(zhi)放在註射器(qi)針(zhen)管(guan)中(zhong)擠(ji)壓(ya)或(huo)在不銹(xiu)鋼(gang)紗網內用鈍物壓(ya)擠(ji)(常(chang)用註射器(qi)鈍端)使細胞(bao)從網孔(kong)中壓(ya)擠(ji)出(chu)。此法(fa)分(fen)離細胞(bao)雖(sui)然(ran)簡便、快(kuai)速(su)，但(dan)對(dui)組(zu)織(zhi)機(ji)械(xie)損(sun)傷(shang)大(da)，而(er)且(qie)細胞(bao)分(fen)散效(xiao)果(guo)差，僅(jin)適(shi)用於處理(li)纖(xian)維成分(fen)少的(de)軟組織(zhi)。

(二)消化(hua)分(fen)離法(fa)

    消化(hua)分(fen)離法(fa)是(shi)把切成較小(xiao)體積，應用酶的(de)生化作(zuo)用和(he)非酶的(de)化學(xue)作用進壹步分(fen)散組(zu)織(zhi)的(de)方法(fa)。zui後使被(bei)處理(li)的(de)組織(zhi)分(fen)散成細胞(bao)團或(huo)單個(ge)細胞(bao)，加(jia)入培(pei)養液(ye)後制(zhi)成細胞(bao)懸(xuan)液(ye)，接種(zhong)入培(pei)養容(rong)器(qi)中(zhong)後，細胞(bao)容易生(sheng)長(chang)繁(fan)殖。各(ge)種(zhong)消化(hua)劑作用機(ji)制(zhi)各(ge)不(bu)相同，根(gen)據(ju)組織(zhi)的(de)不同．可選用特(te)定(ding)的(de)消化(hua)手段。使(shi)用的(de)消化(hua)劑包括酶類和(he)非酶EDTA。

．消化(hua)分(fen)離法(fa)種(zhong)類

()消化(hua)法(fa)：(簡(jian)稱)是(shi)廣泛應用的(de)消化(hua)劑。對(dui)細胞(bao)的(de)作用，取決(jue)於細胞(bao)類型、酶的(de)活(huo)力(li)、配(pei)制(zhi)的(de)濃度、消化(hua)的(de)溫(wen)度、無(wu)機(ji)鹽(yan)離(li)子(zi)、pH以(yi)及消化(hua)時(shi)間的(de)長(chang)短等(deng)。適(shi)於消化(hua)細胞(bao)問(wen)質(zhi)較少(shao)的(de)軟組織(zhi)，能有效(xiao)地(di)分(fen)離肝(gan)、腎(shen)、甲狀腺、羊膜、胚(pei)胎(tai)組(zu)織(zhi)、上皮組織(zhi)等(deng)。鈣(gai)、鎂(mei)離子(zi)對(dui)的(de)活(huo)性(xing)有壹定(ding)的(de)抑(yi)制(zhi)作用，兇此，采(cai)用無(wu)鈣(gai)、鎂(mei)離子(zi)的(de)PBS。壹般采(cai)用的(de)濃度為0．％～0．25％(活(huo)力(li)l：200或(huo)：250)。常(chang)使用的(de)消化(hua)溫(wen)度為37℃，消化(hua)分(fen)離細胞(bao)時(shi)pH適(shi)宜選用7．6～8．0之(zhi)間，否則對(dui)細胞(bao)有損(sun)傷。消化(hua)5mm3大(da)小(xiao)的(de)軟組織(zhi)，消化(hua)時(shi)間為20~30min為宜，但(dan)遇到(dao)難消化(hua)的(de)組織(zhi)時(shi)，濃度可適(shi)當(dang)提(ti)高，消化(hua)時(shi)間適(shi)當(dang)延(yan)長(chang)至數(shu)小(xiao)時(shi)。可采(cai)用冷消化(hua)，使(shi)用低濃度消化(hua)液(ye)，於4℃過(guo)夜(ye)。

(2)膠(jiao)原酶消化(hua)法(fa)：膠(jiao)原酶是(shi)壹種(zhong)從細菌中提取出(chu)來的(de)酶，對(dui)膠(jiao)原有(you)很(hen)強的(de)消化(hua)作(zuo)用。適(shi)於消化(hua)纖(xian)維性組(zu)織(zhi)、上皮組織(zhi)以(yi)及癌組織(zhi)，同時(shi)對(dui)細胞(bao)間質(zhi)有較(jiao)好(hao)的(de)消化(hua)作(zuo)用，而使細胞(bao)不受(shou)傷害。該酶在(zai)有(you)鈣(gai)、鎂(mei)離子(zi)存(cun)在仍有活(huo)性(xing)，故可用PBS和(he)含(han)血清的(de)培(pei)養液(ye)配制(zhi)，zui終(zhong)濃(nong)度200U／ml或(huo)0．～O．3μg／ml。此酶消化(hua)作(zuo)用緩和(he)，無(wu)需機(ji)械(xie)振(zhen)蕩(dang)，但(dan)膠(jiao)原酶價(jia)格(ge)較高，大(da)量使(shi)用將(jiang)增加(jia)實(shi)驗(yan)成本。

    由於上(shang)皮(pi)細胞(bao)對(dui)酶有(you)耐(nai)受性(xing)，經過(guo)膠(jiao)原酶消化(hua)後的(de)上皮組(zu)織(zhi)，可能(neng)有(you)壹些上(shang)皮(pi)細胞(bao)團塊尚未(wei)被(bei)*消化(hua)開(kai)。成小(xiao)團塊的(de)上皮細胞(bao)比(bi)分(fen)散的(de)單個(ge)上皮(pi)細胞(bao)更(geng)易生(sheng)長(chang)，因(yin)此不(bu)必要(yao)冉進(jin)壹步消化(hua)處理(li)。

(3)EDTA消化(hua)法(fa)：EDTA是(shi)壹種(zhong)非(fei)酶消化(hua)物。常(chang)用不含(han)鈣(gai)、鎂(mei)離子(zi)的(de)PBS配成0．02％工(gong)作(zuo)液(ye)，對(dui)壹些組(zu)織(zhi)．尤其是上(shang)皮(pi)組(zu)織(zhi)分(fen)散效(xiao)果(guo)好(hao)。EDTA能(neng)與(yu)細胞(bao)上的(de)鈣(gai)、鎂(mei)離子(zi)結合形(xing)成螯(ao)合物，利用結合後的(de)機(ji)械(xie)力(li)使(shi)細胞(bao)變圓(yuan)而(er)分(fen)散細胞(bao)或(huo)使貼壁細胞(bao)從瓶壁上(shang)脫(tuo)離。EDTA常(chang)不單獨(du)使用，可與(yu)混(hun)合使(shi)用(：或(huo)2：)，不僅利於細胞(bao)脫(tuo)壁又(you)利於細胞(bao)分(fen)散，可降低的(de)用量和(he)毒(du)性作用。

2．材料

()標(biao)本：各(ge)類實(shi)體(ti)組織(zhi)材料。

(2)試劑：消化(hua)液(ye)、PBS、Hanks液(ye)、培(pei)養液(ye)。

(3)器(qi)具：眼科剪、不(bu)銹(xiu)鋼(gang)(尼(ni)龍)的(de)篩網(wang)；平(ping)皿(min)、三(san)角(jiao)燒瓶(ping)、吸管(guan)、離(li)心(xin)管(guan)、培(pei)養瓶(ping)、載(zai)玻片。

3．消化(hua)分(fen)離法(fa)的(de)操作步(bu)驟(以(yi)消化(hua)為例)

()漂洗：將(jiang)組織(zhi)塊在三(san)角(jiao)燒瓶(ping)(或(huo)平皿)中用無(wu)鈣(gai)、鎂(mei)PBS液(ye)洗2～3次(ci)。

(2)剪切：組織(zhi)塊剪碎，剪成3~5mm。大(da)小(xiao)的(de)小(xiao)塊。

(3)消化(hua)：剪碎的(de)組織(zhi)塊放人(ren)三(san)角(jiao)燒瓶(ping)中，加(jia)入比(bi)組織(zhi)量多(duo)30~50倍(bei)的(de)0．25％消化(hua)液(ye)。置於電(dian)磁攪(jiao)拌器(qi)臺上，消化(hua)30~60min，或(huo)置於37℃水浴鍋(guo)(37℃溫(wen)箱中(zhong))，中(zhong)間每隔5～0 min可輕(qing)搖(yao)次，組(zu)織(zhi)塊膨松(song)呈絮(xu)狀可終(zhong)止(zhi)。如果(guo)需要(yao)長(chang)時(shi)間的(de)消化(hua)可更(geng)換(huan)壹次消化(hua)液(ye)，靜(jing)止(zhi)三(san)角(jiao)燒瓶(ping)0min，待組(zu)織(zhi)下沈後，吸出(chu)2／3上清液(ye)，余下／3，再補加(jia)新的(de)消化(hua)液(ye)，繼續消化(hua)。

(4)消化(hua)完畢(bi)，倒(dao)入離心(xin)管(guan)中(zhong)，800r／min離(li)心(xin)6~8min，去上(shang)清液(ye)。

(5)漂洗：采(cai)用Hanks液(ye)漂洗2~3min，離(li)心(xin)去上(shang)清液(ye)，共(gong)2次(ci)。

(6)低(di)速(su)離心(xin)(500~000r／min)：離心(xin)5min，去上(shang)清液(ye)，加(jia)入壹定(ding)量的(de)培(pei)養液(ye)，通過(guo)00μm的(de)網眼的(de)尼(ni)龍網(wang)或(huo)不銹(xiu)鋼(gang)紗網濾(lv)過(guo)，以(yi)除(chu)去未(wei)消化(hua)的(de)較大(da)組(zu)織(zhi)塊；如果(guo)消化(hua)*可不(bu)用濾(lv)過(guo)。用吸管(guan)吸(xi)取(qu)壹滴細胞(bao)懸(xuan)液(ye)滴於載(zai)玻片上(shang)觀(guan)察(cha)，如果(guo)細胞(bao)分(fen)散良(liang)好(hao)，形(xing)態整(zheng)，即(ji)可用於培(pei)養。

4．註(zhu)意事項(xiang)

()組織(zhi)塊必須(xu)漂洗2～3次(ci)以(yi)除(chu)去組(zu)織(zhi)中的(de)鈣(gai)、鎂(mei)離子(zi)和(he)血清對(dui)的(de)抑(yi)制(zhi)作用。

(2)濃度高對(dui)細胞(bao)有毒(du)性，濃度不宜過高；作(zuo)用時(shi)間不能太(tai)長(chang)，以(yi)避免(mian)毒(du)性作用。

(3)消化(hua)後組織(zhi)不僅要盡量棄去消化(hua)液(ye)，以(yi)避免(mian)毒(du)性產生，而(er)且動(dong)作(zuo)要輕(qing)以(yi)避免(mian)蓬(peng)松(song)的(de)細胞(bao)隨漂洗而(er)丟(diu)失(shi)。