富集培(pei)養(yang)後(hou)的純(chun)化(hua)分(fen)離(li)

    富(fu)集培(pei)養(yang)以後(hou)的樣(yang)品(pin)中目(mu)的微生(sheng)物(wu)雖(sui)然(ran)已(yi)占了優勢(shi)，但其(qi)他(ta)微生(sheng)物(wu)仍然存在。因(yin)此，為(wei)了(le)獲(huo)得(de)某壹特定(ding)的微生(sheng)物(wu)菌種，必須對富(fu)集培(pei)養(yang)後(hou)的樣(yang)品(pin)進行純化(hua)分(fen)離(li)。ELISA試劑(ji)盒(he)

()純種分(fen)離(li)的基(ji)本方法(fa)純(chun)種分(fen)離(li)通(tong)常采用(yong)稀(xi)釋(shi)法(fa)和(he)畫線(xian)法(fa)。畫(hua)線法(fa)是(shi)用(yong)接種針(zhen)挑(tiao)取(qu)微生(sheng)物(wu)樣(yang)品(pin)在固(gu)體培(pei)養(yang)基表(biao)面(mian)畫線，培(pei)養後(hou)獲(huo)得(de)單菌(jun)落(luo)。畫線(xian)法(fa)簡(jian)便(bian)、快(kuai)速(su)，但所(suo)得(de)到的(de)單菌(jun)落(luo)不壹(yi)定(ding)是(shi)純(chun)種。稀(xi)釋(shi)法(fa)是(shi)先(xian)將(jiang)樣(yang)品(pin)經(jing)無(wu)菌(jun)水或(huo)生(sheng)理(li)鹽(yan)水稀(xi)釋(shi)後(hou)，再塗布(bu)到固(gu)體(ti)培(pei)養(yang)基上(shang)，培養後(hou)獲(huo)得(de)單菌(jun)落(luo)。稀(xi)釋(shi)法(fa)使(shi)微生(sheng)物(wu)樣(yang)品(pin)分(fen)散(san)更(geng)加(jia)均(jun)勻，獲(huo)得(de)純種的概(gai)率更(geng)大(da)。

(2)通(tong)過控制(zhi)營(ying)養和(he)培養(yang)條件(jian)進行純種分(fen)離(li)

①控制(zhi)分(fen)離(li)培養(yang)基中的(de)營養成(cheng)分(fen)不(bu)同(tong)微生(sheng)物(wu)對碳(tan)源(yuan)、氮源的需(xu)求不壹(yi)樣(yang)。因(yin)此需要(yao)事先(xian)了(le)解(jie)被(bei)分(fen)離(li)微生(sheng)物(wu)的營養要(yao)求，設計(ji)壹種合理(li)快(kuai)速(su)的(de)分(fen)離(li)培養(yang)基，這(zhe)樣(yang)就能(neng)夠收(shou)到(dao)事半(ban)功(gong)倍(bei)的效(xiao)果(guo)。例如(ru)以澱(dian)粉為(wei)碳(tan)源(yuan)的培養基(ji)可鑒別(bie)菌落(luo)能(neng)否(fou)產生；以纖維(wei)素(su)為碳(tan)源(yuan)的培養基(ji)可鑒別(bie)菌落(luo)能(neng)否(fou)產生纖維(wei)素(su)酶；以酪(lao)蛋(dan)白(bai)為(wei)氮源的(de)培養基(ji)可鑒別(bie)菌落(luo)能(neng)否(fou)產生蛋(dan)白(bai)酶(mei)。

②控制(zhi)培(pei)養基的(de)pH值(zhi)不(bu)同微生(sheng)物(wu)對pH值的要(yao)求不同(tong)。細(xi)菌(jun)、放(fang)線菌(jun)的生(sheng)長繁殖(zhi)壹(yi)般(ban)要(yao)求偏堿(jian)(pH7．0～7．5)的(de)生長環(huan)境，而(er)黴(mei)菌(jun)和(he)酵母菌則(ze)要(yao)求偏酸(pH4．5～6．0)的(de)生長環(huan)境。因(yin)此．配(pei)制(zhi)分(fen)離(li)培養(yang)基時(shi)應(ying)調(tiao)節pH到(dao)被(bei)分(fen)離(li)微生(sheng)物(wu)的要(yao)求範圍，這(zhe)樣(yang)既(ji)有利於所(suo)需菌(jun)種的生(sheng)長．也可排(pai)除壹(yi)部(bu)分(fen)不(bu)需(xu)要(yao)的菌種。例如(ru)分(fen)離(li)檸檬(meng)酸產(chan)生菌(jun)時(shi)，調(tiao)節培(pei)養(yang)基(ji)的pH到2．0～2．5，這(zhe)樣(yang)有(you)利於分(fen)離(li)到產(chan)生檸檬酸的(de)黑曲黴(mei)。又(you)如(ru)分(fen)離(li)堿(jian)性(xing)蛋(dan)白(bai)酶(mei)和(he)堿(jian)性(xing)脂(zhi)肪(fang)酶產生菌時(shi)，可以將培(pei)養(yang)基pH調(tiao)到9～，能(neng)起到(dao)濃縮(suo)這(zhe)些(xie)菌種的作(zuo)用(yong)。

    培養基(ji)pH還要(yao)考慮其他(ta)成(cheng)分(fen)。微生(sheng)物(wu)在生(sheng)長繁殖(zhi)過程中，由(you)於代謝作(zuo)用(yong)，會產生(sheng)酸和(he)堿(jian)，使(shi)pH會發生(sheng)變化(hua)。壹(yi)般培養基(ji)C／N高，培(pei)養後(hou)傾向於酸性(xing)，反之則(ze)傾向於堿(jian)性(xing)。無(wu)機(ji)鹽(yan)的性質也會影響(xiang)pH變化(hua)，如(ru)(NH 4)2 SO4是(shi)生(sheng)理(li)酸性(xing)氮源(yuan)，NaNO3是(shi)生(sheng)理(li)堿(jian)性(xing)氮源。為(wei)了(le)維(wei)持培(pei)養(yang)基(ji)的pH值，壹(yi)般要(yao)加入磷(lin)酸鹽(yan)，使培養基(ji)具(ju)緩沖能(neng)力。如(ru)果培養(yang)基中的(de)酸堿(jian)度(du)變化(hua)很大(da)，磷(lin)酸鹽(yan)的緩沖容量不足(zu)，則(ze)可加入(ru)適量(liang)碳(tan)酸鈣(gai)，以不斷中和(he)菌體(ti)代謝過程中產(chan)生的酸類(lei)，使培(pei)養基的pH保(bao)持(chi)在恒(heng)定的(de)範圍內。

③控制(zhi)培(pei)養溫(wen)度各(ge)類微生(sheng)物(wu)的生長溫(wen)度不(bu)同。根據(ju)微生(sheng)物(wu)對生長溫(wen)度的(de)需求不同(tong)，可將微生(sheng)物(wu)分(fen)為(wei)三(san)類(lei)：*類(lei)是(shi)嗜(shi)熱(re)微生(sheng)物(wu)．zui適溫(wen)度50～60℃；第(di)二類為(wei)嗜(shi)溫(wen)微生(sheng)物(wu)，zui適生(sheng)長溫(wen)度是(shi)20～40℃；第(di)三(san)類(lei)是(shi)嗜(shi)冷微生(sheng)物(wu)，zui適溫(wen)度為(wei)5℃以下(xia)。因(yin)此(ci)可控制(zhi)培(pei)養溫(wen)度以獲(huo)得(de)所(suo)需要(yao)的微生(sheng)物(wu)。

④供氧條件(jian)的控制(zhi)不(bu)同微生(sheng)物(wu)對氧的需求不壹(yi)樣(yang)，好氧菌(jun)要(yao)在有(you)氧條件(jian)下(xia)培(pei)養(yang)，而(er)厭氧菌則(ze)要(yao)在厭氧條件(jian)下(xia)才能(neng)生(sheng)長。ELISA試劑(ji)盒(he)

    分(fen)離(li)厭氧菌．要(yao)采取(qu)厭氧培養法(fa)，培(pei)養過程中要(yao)除去氧氣(qi)。可在分(fen)離(li)培養(yang)基中加(jia)入還原劑．如(ru)半(ban)、D型(xing)、硫化(hua)鈉等(deng)，快(kuai)速(su)畫(hua)線(xian)後(hou)，立(li)即置真空密(mi)封(feng)容器中(充(chong)二氧化(hua)碳(tan)或(huo)氮(dan)氣)；也可利用(yong)焦性(xing)沒(mei)食子(zi)酸和(he)NaOH反應(ying)，除(chu)去氧氣(qi)。

(3)利用(yong)平皿的(de)生化(hua)反應(ying)進行分(fen)離(li)(圖(tu)2．35) 這(zhe)是(shi)利用(yong)特殊(shu)的分(fen)離(li)培養(yang)基對微生(sheng)物(wu)進行初步(bu)分(fen)離(li)的方(fang)法(fa)。分(fen)離(li)培養(yang)基是(shi)根(gen)據(ju)目(mu)的微生(sheng)物(wu)的特殊(shu)生理(li)特性(xing)或(huo)其(qi)代謝產物(wu)的生化(hua)反應(ying)進行設計(ji)的。通(tong)過觀察(cha)微生(sheng)物(wu)在特殊(shu)分(fen)離(li)培養(yang)基上的生長情況(kuang)或(huo)生(sheng)化(hua)反應(ying)進行分(fen)離(li)，可顯(xian)著提(ti)高目(mu)的微生(sheng)物(wu)分(fen)離(li)純化(hua)的(de)效(xiao)率。

①透(tou)明圈(quan)法(fa)在平(ping)板(ban)培(pei)養基(ji)中加(jia)入溶(rong)解(jie)性(xing)較差的底物(wu)，使培養基混濁。將(jiang)含(han)目的微生(sheng)物(wu)的待分(fen)離(li)樣(yang)品(pin)接種到此(ci)培(pei)養基中進行培養，能(neng)分(fen)解(jie)底(di)物(wu)的微生(sheng)物(wu)便(bian)會在菌(jun)落(luo)周圍產生(sheng)透(tou)明圈(quan)，透(tou)明圈(quan)的(de)大(da)小(xiao)可初步(bu)反映該菌株(zhu)利用(yong)底物(wu)的能(neng)力。該法(fa)多用(yong)於分(fen)離(li)水解(jie)酶(mei)產(chan)生(sheng)菌(jun)，如(ru)以澱(dian)粉為(wei)碳(tan)源(yuan)的培養基(ji)可鑒別(bie)菌落(luo)能(neng)否(fou)產生；以纖維(wei)素(su)為碳(tan)源(yuan)的培養基(ji)可鑒別(bie)菌落(luo)能(neng)否(fou)產生纖維(wei)素(su)酶；以酪(lao)蛋(dan)白(bai)為(wei)氮源的(de)培養基(ji)可鑒別(bie)菌落(luo)能(neng)否(fou)產生蛋(dan)白(bai)酶(mei)。根據菌(jun)落(luo)周圍形成(cheng)的透(tou)明圈(quan)的(de)有無(wu)和(he)大(da)小(xiao)，可以大(da)致(zhi)確定酶(mei)活力的有無(wu)和(he)強弱(ruo)。

    產(chan)有機(ji)酸的(de)微生(sheng)物(wu)也可采用(yong)透(tou)明圈(quan)法(fa)進行分(fen)離(li)。在分(fen)離(li)培養(yang)基中加(jia)碳(tan)酸鈣(gai)，使之形成(cheng)混濁狀(zhuang)，把土樣(yang)懸(xuan)浮液(ye)塗到(dao)平(ping)板(ban)上(shang)，如(ru)在培(pei)養過程中產(chan)酸，則(ze)能(neng)把(ba)菌落(luo)四(si)周(zhou)的(de)碳(tan)酸鈣(gai)水解(jie)，形(xing)成(cheng)清晰的(de)透(tou)明圈(quan)。

②變(bian)色圈法(fa)在分(fen)離(li)培養(yang)基中加(jia)入指示劑(ji)或(huo)顯(xian)色劑，可使所(suo)需微生(sheng)物(wu)能(neng)被(bei)鑒別(bie)出(chu)來(lai)。如(ru)分(fen)離(li)產生(sheng)菌時(shi)．在培(pei)養基(ji)中加(jia)入溴百(bai)裏酚藍(lan)，它(ta)是(shi)壹(yi)種酸堿(jian)指(zhi)示劑(ji)，變色(se)範圍在pH6．2～7．6，當pH6．2以下(xia)時(shi)為(wei)黃色，當pH7．6以上時(shi)為(wei)藍(lan)色(se)。若平(ping)板(ban)上(shang)出(chu)現產酸菌(jun)，其菌(jun)落(luo)周圍會變成(cheng)黃色，可挑取(qu)黃色菌落(luo)，進壹步(bu)篩選(xuan)產生(sheng)菌(jun)。

    分(fen)離(li)降脂(zhi)微生(sheng)物(wu)的常用(yong)方法(fa)是(shi)把(ba)維(wei)多利亞(ya)蘭(lan)和(he)脂(zhi)類混合，制(zhi)成(cheng)瓊脂(zhi)培養基平板(ban)，起始(shi)pH調(tiao)為中性(xing)，將土樣(yang)懸(xuan)浮液(ye)分(fen)離(li)在平(ping)板(ban)上(shang)，具(ju)有降(jiang)脂(zhi)能(neng)力的菌落(luo)產生(sheng)脂(zhi)酶，水解(jie)脂(zhi)類底物(wu)，使pH由(you)中性(xing)下(xia)降(jiang)到(dao)酸性(xing)，即陽(yang)性降脂(zhi)反應(ying)能(neng)顯(xian)示粉(fen)紅色(se)到(dao)藍(lan)色(se)的變(bian)化(hua)。若(ruo)起始(shi)pH為
堿(jian)性(xing)．則(ze)陽(yang)性(xing)降(jiang)脂(zhi)反應(ying)從咖啡(fei)色變(bian)成(cheng)藍(lan)綠(lv)色，能(neng)使(shi)脂(zhi)類底物(wu)與降(jiang)脂(zhi)後(hou)的脂(zhi)肪(fang)酸區(qu)別(bie)開(kai)來(lai)。

    分(fen)離(li)蛋(dan)白(bai)酶(mei)產生菌(jun)時(shi)．除(chu)可用(yong)酪(lao)蛋(dan)白(bai)作(zuo)底物(wu)，觀察菌落(luo)周圍有無(wu)透(tou)明圈(quan)外(wai)，還(hai)可以吲羥乙酸酯為(wei)底物(wu)，能(neng)產(chan)生堿(jian)性(xing)蛋(dan)白(bai)酶(mei)的芽胞(bao)桿菌(jun)菌落(luo)，由(you)於水解(jie)吲(yin)羥乙酸酯而(er)產(chan)生(sheng)3壹(yi)羥基吲哚，後(hou)者(zhe)能(neng)氧(yang)化(hua)產(chan)生藍(lan)色(se)產物(wu)，以此鑒別(bie)菌落(luo)是(shi)否(fou)產(chan)蛋(dan)白(bai)酶(mei)。

③生長圈法(fa)生(sheng)長圈法(fa)通(tong)常用(yong)於分(fen)離(li)和(he)篩選(xuan)產生(sheng)氨基(ji)酸、核(he)苷(gan)酸和(he)維(wei)生素(su)的微生(sheng)物(wu)。所(suo)用(yong)工具(ju)菌是(shi)壹(yi)些(xie)相對(dui)應(ying)的(de)營(ying)養(yang)缺(que)陷型(xing)菌(jun)株(zhu)。將待(dai)分(fen)離(li)菌株(zhu)塗布於含高濃度的工(gong)具(ju)菌並(bing)缺(que)少所(suo)需營(ying)養物(wu)的平板(ban)上(shang)進行培養，則(ze)在能(neng)合成(cheng)該營養(yang)物(wu)的菌落(luo)周圍會產生(sheng)壹個混濁的(de)生(sheng)長圈。

④抑菌圈法(fa)抑菌圈法(fa)常(chang)用(yong)於分(fen)離(li)和(he)篩選(xuan)產生(sheng)抗生素(su)的微生(sheng)物(wu)。所(suo)用(yong)工具(ju)菌為(wei)抗生素(su)的敏感(gan)菌(jun)。若被分(fen)離(li)微生(sheng)物(wu)能(neng)產(chan)生某種抗生素(su)．便(bian)會在該菌落(luo)周圍形成(cheng)工具(ju)菌不(bu)能(neng)生(sheng)長的抑菌圉(yu)。ELISA試劑(ji)盒(he)

    利用(yong)抑菌圈法(fa)還(hai)能(neng)篩選(xuan)產生(sheng)某些(xie)酶類(lei)的(de)微生(sheng)物(wu)。如(ru)可利用(yong)抑菌圈法(fa)篩選(xuan)酰化(hua)酶(mei)產生菌。工(gong)具(ju)菌為(wei)壹(yi)種對芐(bian)抗性而(er)對(dui)6壹(yi)氨基(ji)青(qing)黴(mei)烷(wan)酸(6壹(yi)APA)敏感(gan)的黏(nian)性沙(sha)雷(lei)氏(shi)菌。這(zhe)種菌只(zhi)有(you)當芐(bian)青(qing)黴(mei)索尚未被(bei)酰(xian)化(hua)酶(mei)轉(zhuan)化(hua)為(wei)6壹APA時(shi)才能(neng)生(sheng)長。具(ju)體做法(fa)是(shi)將(jiang)工(gong)具(ju)菌和(he)芐(bian)混合於平板(ban)培(pei)養基(ji)中，將(jiang)待分(fen)離(li)菌塗(tu)布於平皿上(shang)培養．凡菌落(luo)周圍出(chu)現抑菌圈的即(ji)為(wei)酰化(hua)酶(mei)產生菌。