抗體(ti)的活(huo)性(xing)至關重要(yao)

    選擇瘤細(xi)胞(bao)株(zhu)的zui重要(yao)的(de)壹(yi)點是與待(dai)融(rong)合的B細(xi)胞(bao)同(tong)源。如待(dai)融(rong)合的是脾細(xi)胞(bao)，各(ge)種(zhong)骨(gu)髓(sui)瘤細(xi)胞(bao)株(zhu)均可應用(yong)，但應用(yong)zui多(duo)的(de)是Sp2/0細(xi)胞(bao)株(zhu)。該(gai)細(xi)胞(bao)株(zhu)生長及(ji)融(rong)合效率(lv)均佳，此外，該(gai)細(xi)胞(bao)株(zhu)本身不分(fen)泌(mi)任(ren)何(he)免疫球蛋白(bai)重鏈或(huo)輕鏈(lian)。細(xi)胞(bao)的(de)zui高(gao)生長刻(ke)度為9×05/ml，倍增時(shi)間(jian)通(tong)常(chang)為0～5h。融(rong)合細(xi)胞(bao)應(ying)選擇處於(yu)對(dui)數(shu)生、細(xi)胞(bao)形(xing)態和活性佳的細(xi)胞(bao)（活(huo)性應大於(yu)95％）。骨(gu)髓(sui)瘤細(xi)胞(bao)株(zhu)在融(rong)合前應先用(yong)含8-氮的培養(yang)基作適(shi)應培養(yang)，在(zai)細(xi)胞(bao)融(rong)合的前壹(yi)天用新鮮培養(yang)基調細(xi)胞(bao)濃(nong)度為205/ml，次(ci)日(ri)壹(yi)般即為對(dui)數(shu)生細(xi)胞(bao)。
    在(zai)體(ti)外培(pei)養(yang)條(tiao)件下(xia)，細(xi)胞(bao)的(de)生長依(yi)賴(lai)適當(dang)的(de)細(xi)胞(bao)密度，因(yin)而(er)，在培養(yang)融(rong)合細(xi)胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)克(ke)隆化(hua)培(pei)養(yang)時(shi)，還需(xu)加入其(qi)他(ta)飼養(yang)細(xi)胞(bao)（feedercell）。常(chang)用的飼養(yang)細(xi)胞(bao)為小鼠的腹(fu)腔細(xi)胞(bao)，制(zhi)備方(fang)法(fa)為用冷凍果(guo)糖(tang)液註(zhu)入(ru)小鼠腹(fu)腔，輕(qing)揉腹(fu)部(bu)數(shu)次(ci)，吸出(chu)後(hou)的(de)液(ye)體(ti)中即(ji)含(han)小鼠腹(fu)腔細(xi)胞(bao)，其(qi)中在巨噬(shi)細(xi)胞(bao)和其他細(xi)胞(bao)。亦(yi)有(you)用(yong)小鼠的脾細(xi)胞(bao)、大鼠或(huo)豚鼠(shu)的(de)腹(fu)腔細(xi)胞(bao)作為飼養(yang)細(xi)胞(bao)的(de)。
在制備飼養(yang)細(xi)胞(bao)時(shi)，切(qie)忌(ji)針(zhen)頭刺(ci)破動(dong)物(wu)的消化(hua)器官(guan)，否則所(suo)獲(huo)細(xi)胞(bao)會(hui)有(you)嚴(yan)重汙染(ran)。飼(si)養(yang)細(xi)胞(bao)調(tiao)至×05/ml，提(ti)前壹(yi)天或(huo)當天(tian)置(zhi)板孔(kong)中(zhong)培(pei)養(yang)。
細(xi)胞(bao)融(rong)合
    細(xi)胞(bao)融(rong)合是雜(za)交瘤技術(shu)的中(zhong)心(xin)環(huan)節(jie)，基本步驟是將兩(liang)種(zhong)細(xi)胞(bao)混(hun)合後(hou)加入PEG使(shi)細(xi)胞(bao)彼(bi)此(ci)融(rong)合。其後(hou)吧培(pei)養(yang)液(ye)稀釋(shi)PEG，消除PEG的(de)作用(yong)。將融(rong)合後(hou)的(de)細(xi)胞(bao)適(shi)當稀釋(shi)，分(fen)置培養(yang)板孔(kong)中(zhong)培(pei)養(yang)。融(rong)合過程中(zhong)有(you)幾(ji)個(ge)問題(ti)應特(te)別(bie)註意。①細(xi)胞(bao)比(bi)例：骨(gu)髓(sui)瘤細(xi)胞(bao)與脾細(xi)胞(bao)的(de)比值可從(cong):2到:0不等(deng)，常(chang)用:4的(de)比例(li)。應保證(zheng)兩(liang)種細(xi)胞(bao)在(zai)融(rong)合前都具有(you)較(jiao)高(gao)活(huo)性。②反應(ying)時(shi)間(jian)：在(zai)兩種細(xi)胞(bao)的(de)混合細(xi)胞(bao)懸液中(zhong)，第min滴加4.5ml培養(yang)液(ye)；間隔2min滴加5ml培養(yang)液(ye)，爾(er)後(hou)加培養(yang)液(ye)50ml。③培養(yang)液(ye)的成(cheng)分：對(dui)融(rong)合細(xi)胞(bao)，良好(hao)的(de)培(pei)養(yang)液(ye)尤其重要(yao)，其(qi)中(zhong)的(de)小牛(niu)血清、各(ge)種(zhong)離子和營養(yang)成(cheng)分均需嚴格配(pei)制(zhi)。如融(rong)合效率(lv)降(jiang)低(di)，應隨(sui)時(shi)核(he)查培養(yang)基情況。
有(you)限(xian)稀釋(shi)法(fa)
    篩選陽性株壹(yi)般選用的骨(gu)髓(sui)瘤細(xi)胞(bao)為HAT敏感(gan)細(xi)胞(bao)株(zhu)，所(suo)以只(zhi)有(you)融(rong)合的細(xi)胞(bao)才(cai)能(neng)待(dai)續(xu)存(cun)活(huo)壹(yi)周(zhou)以上。融(rong)合細(xi)胞(bao)呈克隆生長，經(jing)有(you)限(xian)稀釋(shi)後(hou)（壹(yi)般稀釋(shi)至(zhi)0.8個(ge)細(xi)胞(bao)/ 孔(kong)），按(an)Poisson法計(ji)算(suan)，應有(you)36％的(de)孔(kong)為個(ge)細(xi)胞(bao)/孔(kong)。細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)至(zhi)覆(fu)蓋0％～20％孔(kong)底(di)時(shi)，吸取(qu)培養(yang)上清用ELISA檢測(ce)抗體(ti)含量。首先依(yi)抗體(ti)的分(fen)泌(mi)情況篩選出(chu)高(gao)抗體(ti)分泌(mi)孔(kong)，將孔(kong)中(zhong)細(xi)胞(bao)再(zai)行克隆化(hua)，爾(er)後(hou)進(jin)行抗原(yuan)特異(yi)的ELISA測(ce)定，選高(gao)分(fen)泌(mi)特異(yi)性細(xi)胞(bao)株(zhu)擴大培養(yang)或(huo)凍存。
單克隆抗體(ti)的制(zhi)備和凍存
    篩(shai)選出(chu)的(de)陽性(xing)細(xi)胞(bao)株(zhu)應及(ji)早(zao)進行抗體(ti)制備，因(yin)為融(rong)合細(xi)胞(bao)隨(sui)培養(yang)時(shi)間(jian)延長，發(fa)生汙染(ran)、染(ran)包體(ti)丟失和細(xi)胞(bao)死(si)亡(wang)的(de)機率(lv)增加。抗體(ti)制備有(you)兩(liang)種方(fang)法(fa)。壹(yi)是增量培(pei)養(yang)法(fa)，即將雜(za)交瘤細(xi)胞(bao)在(zai)體(ti)外培(pei)養(yang)，在(zai)培養(yang)液(ye)中分離單克隆抗體(ti)。該(gai)法需(xu)用(yong)特(te)殊(shu)的(de)儀器設備，壹(yi)般應用無血清培養(yang)基，以利於(yu)單克隆抗體(ti)的濃(nong)縮(suo)和純(chun)化(hua)。zui普(pu)遍(bian)采用的(de)是小鼠腹(fu)腔接(jie)種(zhong)法(fa)。選用BALB/c 小鼠或(huo)其親(qin)代(dai)小鼠，先用(yong)降植(zhi)烷(wan)或(huo)液體(ti)石(shi)蠟行小鼠腹(fu)腔註(zhu)射(she)，壹(yi)周(zhou)後(hou)將雜(za)交瘤細(xi)胞(bao)接(jie)種到小鼠腹(fu)腔中(zhong)去(qu)。通(tong)常(chang)在接種壹(yi)周(zhou)後(hou)即(ji)有(you)明(ming)顯(xian)的(de)腹(fu)水產生，每只(zhi)小鼠可收(shou)集(ji) 5～0ml的腹(fu)水，有(you)時(shi)甚(shen)至(zhi)超過40ml。該(gai)法制(zhi)備的腹(fu)水抗體(ti)含量高(gao)，每毫(hao)升(sheng)可達數毫(hao)克(ke)甚(shen)至(zhi)數十(shi)毫(hao)克(ke)水(shui)平。此(ci)外，腹(fu)水中(zhong)的(de)雜(za)蛋白(bai)也(ye)較少(shao)，便於(yu)抗體(ti)的純(chun)化(hua)。接(jie)種(zhong)細(xi)胞(bao)的(de)數量應(ying)適(shi)當，壹(yi)般為5×05/鼠，可(ke)根(gen)據(ju)腹(fu)水生長情(qing)況適當(dang)增減(jian)。
選出(chu)的(de)陽性(xing)細(xi)胞(bao)株(zhu)應及(ji)早(zao)凍存。凍存的(de)溫(wen)度越低越好，凍存於(yu)液(ye)氮的細(xi)胞(bao)株(zhu)活性僅有(you)輕(qing)微(wei)的(de)降低(di)，而(er)凍存在(zai)－70℃冰箱(xiang)則(ze)活(huo)性改變(bian)較(jiao)快。細(xi)胞(bao)不(bu)同於(yu)菌種(zhong)，凍存過程中(zhong)需(xu)格外小心(xin)。二(er)甲亞碸(feng)（DMSO）是普遍(bian)應用的(de)凍存保護(hu)劑。凍存細(xi)胞(bao)復蘇(su)後(hou)的(de)活(huo)性(xing)多(duo)在50％～95％之(zhi)間。如果(guo)低(di)於(yu)50％，則(ze)說明(ming)凍存復蘇(su)過程有(you)問題(ti)。
單克隆抗體(ti)的純(chun)化(hua)
    單克隆抗體(ti)的純(chun)化(hua)方(fang)法(fa)同多克隆抗體(ti)的純(chun)化(hua)，腹(fu)水特(te)異(yi)性抗體(ti)的濃(nong)度較(jiao)抗血清中的多克隆抗體(ti)高(gao)，純(chun)化(hua)效(xiao)果(guo)好(hao)。按(an)所(suo)要(yao)求(qiu)的(de)純(chun)度不(bu)同(tong)采用相(xiang)應(ying)的純(chun)化(hua)方(fang)法(fa)。壹(yi)般采用鹽析、凝膠(jiao)過濾和離子交換層(ceng)析等(deng)步(bu)驟達到純(chun)化(hua)目(mu)的(de)，也(ye)有(you)采用較(jiao)簡(jian)單的酸(suan)沈(chen)澱方(fang)法(fa)。目前zui有(you)效(xiao)的單克隆抗體(ti)純(chun)化(hua)方(fang)法(fa)為親和純(chun)化(hua)法(fa)，多(duo)用(yong)葡(pu)萄球菌A 蛋白(bai)或(huo)抗小鼠球蛋白(bai)抗體(ti)與載體(ti)（zui常用(yong)Sepharose）交聯，制備親和層析柱(zhu)將抗體(ti)結合後(hou)洗(xi)脫(tuo)，回(hui)收(shou)率(lv)可(ke)達90％以上。蛋白(bai)可(ke)與IgG、 IgG2a、IgG2b和IgG3結合，同時(shi)還結(jie)合少量的(de)IgM。洗(xi)脫(tuo)液(ye)中(zhong)的(de)抗體(ti)濃度可(ke)用(yong)紫(zi)外光(guang)吸收(shou)法(fa)粗(cu)測(ce)，小鼠IgG單克隆抗體(ti)溶液(ye)在(zai)A280nm 時(shi)，.44（吸光(guang)單位）相(xiang)當(dang)於(yu)mg/ml。經(jing)低(di)pH洗(xi)脫(tuo)後(hou)在(zai)收(shou)集(ji)管內預(yu)置中和液或(huo)速(su)加中和液對(dui)保持純(chun)化(hua)抗體(ti)的活(huo)性(xing)至關重要(yao)。