如何(he)解決(jue)免疫組化(hua)染(ran)色(se)過(guo)程中(zhong)的問(wen)題

如何(he)解決(jue)免疫組化(hua)染(ran)色(se)過(guo)程中(zhong)的問(wen)題

壹(yi)、“雜音(yin)”染(ran)色(se)片
     免疫組化(hua)除(chu)正(zheng)常的真(zhen)實的(de)陽(yang)性信(xin)號外(wai)常常會遇(yu)到(dao)不(bu)正(zheng)常的背景著(zhe)色(se)，這些(xie)非正(zheng)常的著(zhe)色(se)稱為(wei)“雜音(yin)”染(ran)色(se)。“雜音(yin)”染(ran)色(se)種(zhong)類繁(fan)多，產生(sheng)的(de)原(yuan)因(yin)也(ye)多種(zhong)多樣(yang)，為(wei)了便於(yu)說(shuo)明(ming)，筆(bi)者(zhe)將其(qi)歸(gui)納為(wei)下面(mian)幾(ji)種(zhong)。
    、 全片著(zhe)色(se)
    全片著(zhe)色(se)是(shi)指整(zheng)個(ge)切(qie)片全(quan)都(dou)染上(shang)了(le)顏色，著(zhe)色的(de)強(qiang)度可(ke)深可(ke)淺(qian)，總之，分不(bu)清(qing)那些(xie)組織是(shi)陽(yang)性那些(xie)組織是(shi)陰(yin)性。出(chu)現(xian)這種(zhong)現象的(de)原(yuan)因(yin)有(you)：
     （）、抗(kang)體(ti)濃度過(guo)高(gao)：壹(yi)抗(kang)濃度過(guo)高(gao)是(shi)常見的(de)原(yuan)因(yin)之壹。解決(jue)辦法是(shi)，每(mei)次(ci)使用新抗(kang)體(ti)前應當(dang)對其工作(zuo)濃度進(jin)行測試，使每(mei)壹(yi)抗(kang)體(ti)個體(ti)化(hua)，找(zhao)到(dao)適合(he)自己(ji)實驗(yan)室的(de)理(li)想工作(zuo)濃度，既使是(shi)即用型(xing)的(de)抗(kang)體(ti)也應如此(ci)，不(bu)能(neng)只(zhi)簡(jian)單(dan)的按(an)說(shuo)明(ming)書進(jin)行染(ran)色(se)。
    （2）、抗(kang)體(ti)孵育時間過(guo)長或(huo)溫(wen)度(du)較高(gao)：解決(jue)辦法是(shi)，嚴(yan)格執(zhi)行(xing)操作(zuo)規(gui)程，隨(sui)身佩帶報時(shi)表或(huo)報時(shi)鐘，及時提醒(xing)，避(bi)免因遺(yi)忘(wang)而造(zao)成時間延長(chang)。現(xian)在流(liu)行(xing)的二(er)步(bu)法（Polymer）敏感性很(hen)高(gao)，要(yao)求(qiu)壹抗(kang)孵(fu)育的(de)時(shi)間(jian)不(bu)是(shi)傳統的(de)小(xiao)時，而是(shi)30分(fen)鐘，因(yin)此，要(yao)根據(ju)染(ran)色結果進(jin)行調(tiao)整(zheng)。
    （3）、DAB變(bian)質(zhi)和(he)顯(xian)色(se)時(shi)間太(tai)長：DAB現(xian)用現(xian)配(pei)，如有(you)沈(chen)渣應進(jin)行過(guo)濾(lv)後再用。配(pei)制(zhi)好(hao)的DAB不(bu)應(ying)存(cun)放時間(jian)太(tai)長，因(yin)為(wei)在沒(mei)有(you)酶(mei)的情況下，過(guo)氧化(hua)氫(qing)也(ye)會(hui)遊(you)離出(chu)氧原(yuan)子與DAB產生(sheng)反應而(er)降(jiang)低(di)DAB的效(xiao)力，未用完(wan)的(de)DAB存(cun)放在冰(bing)箱(xiang)裏(li)幾(ji)天後再用這(zhe)種(zhong)似(si)乎節(jie)約的辦法是(shi)不(bu)可(ke)取的(de)。DAB的(de)顯(xian)色在顯(xian)微鏡(jing)下監控，達(da)到(dao)理(li)想的(de)染色(se)程度(du)時立(li)即終止(zhi)反應。不(bu)過(guo)當(dang)染色片太(tai)多時或(huo)用染(ran)色(se)機(ji)時(shi)，這樣(yang)做似(si)乎不(bu)現(xian)實，但至少(shao)應對(dui)壹(yi)些(xie)新的或(huo)少用的(de)抗(kang)體(ti)顯色時進(jin)行監控，避(bi)免顯色(se)時(shi)間過(guo)長(chang)。
    （4）、組織變幹：修復(fu)液溢(yi)出(chu)後未及時補充液(ye)體(ti)、染色切(qie)片太(tai)多、動作(zuo)太(tai)慢、忘(wang)記(ji)滴(di)液(ye)、滴(di)液(ye)流(liu)失(shi)等都(dou)是(shi)造(zao)成組織變幹的原(yuan)因(yin)。解決(jue)的辦(ban)法是(shi)操(cao)作(zuo)要(yao)認(ren)真仔細，采(cai)用DAKO筆(bi)或(huo)PAP Pen在組織周圍(wei)畫圈(quan)，可(ke)以有(you)效(xiao)的避免液體(ti)流(liu)失(shi)，也(ye)能(neng)提高(gao)操(cao)作(zuo)速度。
    （5）、切(qie)片在緩沖(chong)液(ye)或(huo)修復(fu)液中(zhong)浸泡時間(jian)太(tai)長（大(da)於(yu)24小(xiao)時(shi)）：原(yuan)因(yin)上(shang)不(bu)清(qing)楚，但現象(xiang)存(cun)在。有(you)的(de)實驗(yan)室喜歡前壹(yi)天將切(qie)片脫蠟(la)至修(xiu)復(fu)，第(di)二(er)天加抗(kang)體(ti)進(jin)行免疫組化(hua)染(ran)色(se)，如果將裝(zhuang)有(you)切(qie)片和(he)修(xiu)復(fu)液的容(rong)器放在4ºC冰(bing)箱(xiang)過(guo)夜(ye)，對(dui)結果無(wu)明(ming)顯影響，如果放(fang)在室(shi)溫(wen)，特(te)別(bie)是(shi)炎(yan)熱的夏天，會出(chu)現(xian)背景著(zhe)色(se)，因此，不(bu)可(ke)存(cun)放時間(jian)太(tai)長。（6）、壹(yi)抗(kang)變(bian)質(zhi)、質(zhi)量(liang)差(cha)的(de)多克(ke)隆(long)抗(kang)體(ti)：註意抗(kang)體(ti)的有(you)效(xiao)期，過期的(de)抗(kang)體(ti)要麼不(bu)顯(xian)色要(yao)麼(me)背景著(zhe)色(se)。用新買的抗(kang)體(ti)時設(she)立(li)陽性對(dui)照和用使用過(guo)的(de)抗(kang)體(ti)作比較。
    2、 切(qie)片邊(bian)緣著(zhe)色(se)
    切(qie)片邊(bian)緣著(zhe)色(se)也是(shi)壹(yi)種(zhong)常見的(de)現(xian)象，這(zhe)種(zhong)現象稱(cheng)為(wei)邊(bian)緣效(xiao)應(ying)。產生(sheng)的原(yuan)因(yin)：（）、組織邊(bian)緣與(yu)玻片粘(zhan)貼(tie)不(bu)牢，邊(bian)緣組織松脫漂(piao)浮在液(ye)體(ti)中(zhong)，每(mei)次(ci)清洗(xi)不(bu)易(yi)將組織下面(mian)試劑(ji)洗(xi)盡所致(zhi)。解決(jue)辦法：制(zhi)備(bei)的膠片（APES或(huo)多聚(ju)賴(lai)氨酸），切(qie)出(chu)盡(jin)量薄的組織切(qie)片，不(bu)厚於(yu)4微米，組織的前期處理(li)應規(gui)範，盡(jin)量避免選用壞(huai)死較多的組織。（2）、切(qie)片上(shang)滴(di)加的(de)試劑(ji)未充(chong)分覆(fu)蓋組織，邊(bian)緣的(de)試劑(ji)容(rong)易(yi)首(shou)先變(bian)幹，濃度較中(zhong)心組織高(gao)而(er)致(zhi)染色深(shen)。解決(jue)辦法：試劑(ji)要(yao)充分(fen)覆蓋組織，應超(chao)出(chu)組織邊(bian)緣2 mm。用DAKO筆(bi)畫圈(quan)時(shi)，為(wei)了避(bi)免油劑(ji)的(de)影響(xiang)，畫圈(quan)應(ying)距組織邊(bian)緣3-4 mm。
    3、“陰(yin)陽(yang)臉”著(zhe)色
    指組織壹半著(zhe)色(se)壹半無(wu)著(zhe)色，形(xing)成交(jiao)界清(qing)晰(xi)或(huo)不(bu)甚(shen)清晰(xi)的(de)兩(liang)種(zhong)染色結(jie)果。其(qi)成因是(shi)試劑(ji)僅覆蓋了部分組織而不(bu)是(shi)全(quan)部。如加試劑(ji)後未讓(rang)試劑(ji)流(liu)散(san)開而(er)集(ji)中(zhong)在部分組織上。通常應該在加完(wan)試劑(ji)後，仔細看壹(yi)遍(bian)，是(shi)否(fou)有(you)的(de)組織未被試劑(ji)*覆(fu)蓋，如有(you)這(zhe)種(zhong)情況，建議(yi)用牙(ya)簽而(er)不(bu)是(shi)用吸頭或(huo)試劑(ji)瓶(ping)口(kou)將試劑(ji)引流(liu)開使之將組織全部覆蓋。另外(wai)，染片盒(he)不(bu)平(ping)，切(qie)片傾斜(xie)，雖(sui)然(ran)開始試劑(ji)已(yi)全部覆蓋了組織，但後來試劑(ji)流(liu)向壹邊(bian)，部分組織未被試劑(ji)覆(fu)蓋。對於(yu)這(zhe)種(zhong)問題，只(zhi)要(yao)留心或(huo)想到(dao)了(le)很(hen)容(rong)易(yi)發(fa)現(xian)，也(ye)很(hen)容(rong)易(yi)解決(jue)。有(you)時(shi)，用DAKO（或(huo)PAP）筆在組織周圍(wei)畫圈(quan)時(shi)，劃線太(tai)靠(kao)近或(huo)畫到(dao)了(le)組織上，由於(yu)筆(bi)油(you)的力學原(yuan)理(li)，試劑(ji)不(bu)能(neng)達(da)到(dao)靠(kao)近劃線附近的(de)組織。還有(you)氣(qi)泡也可(ke)引起陰陽(yang)分明(ming)的著(zhe)色(se)，只是(shi)不(bu)著(zhe)色區(qu)域(yu)是(shi)圓(yuan)形(xing)，由於(yu)氣(qi)泡中(zhong)含氣(qi)，試劑(ji)被推(tui)到(dao)周圍(wei)，因(yin)此(ci)，氣(qi)泡中(zhong)心的(de)組織不(bu)著(zhe)色。解決(jue)辦法是(shi)滴(di)加試劑(ji)時(shi)手法要(yao)輕(qing)，有(you)氣(qi)泡時用牙(ya)簽捅(tong)破。
    4、 竈片狀(zhuang)著(zhe)色
    切(qie)片中(zhong)著色(se)區(qu)東壹(yi)塊(kuai)西壹(yi)塊，呈竈片狀(zhuang)分(fen)布，出(chu)現(xian)這種(zhong)問題的(de)原(yuan)因(yin)有(you)：（）、裱(biao)片時(shi)水(shui)未排盡(jin)，在局部形(xing)成氣(qi)泡使組織突(tu)起，染色(se)時試劑(ji)滲(shen)入後不(bu)易(yi)洗(xi)盡，顯(xian)色過深所致(zhi)。解決(jue)辦法是(shi)，漂(piao)片盒(he)裏的氣(qi)泡應去盡(jin)，晾片熱臺不(bu)能(neng)平(ping)放，應(ying)有(you)45度(du)左右的斜(xie)度(du)，利於(yu)水(shui)流(liu)走和蒸(zheng)發(fa)。（2）、壞(huai)死組織竈，免疫組織壞死後細胞破壞、酶的釋放(fang)、蛋白遊離、分解，復(fu)雜的(de)肽鏈(lian)殘段（如Fc段）可(ke)能(neng)與(yu)壹抗(kang)或(huo)/和二(er)抗(kang)結(jie)合(he)導致zui終著色。解決(jue)辦法是(shi)在選擇染色(se)切(qie)片時(shi)應(ying)避免選擇壞死組織較多的切(qie)片。（3）、制(zhi)作(zuo)APES膠片時(shi)，膠的(de)濃度太(tai)高(gao)，幹燥後在玻片上(shang)留下白色小點(dian)，顯色(se)時(shi)白色小點(dian)著色(se)。解決(jue)辦法是(shi)按(an)照標準(zhun)的(de)制(zhi)備(bei)方(fang)法進(jin)行，即5%鹽酸(suan)酒(jiu)精（5ml鹽(yan)酸+95%酒(jiu)精95ml）浸泡玻片4小(xiao)時(shi)、熱水沖(chong)洗(xi)玻片小(xiao)時(shi)、蒸餾水洗(xi)玻片分(fen)鐘、丙酮(tong)浸泡玻片5秒鐘後空氣(qi)幹燥（室(shi)溫(wen)）、2%APES（2 ml APES+98 ml丙酮(tong)）浸泡玻片5分(fen)鐘、玻片過(guo)壹(yi)下丙酮(tong)（-2秒鐘）、玻片過(guo)壹(yi)下蒸(zheng)餾水（-2秒鐘）、37°C過(guo)夜幹燥、室(shi)溫(wen)儲(chu)存(cun)備(bei)用。如果制(zhi)片過(guo)程中(zhong)，因丙酮(tong)逐(zhu)漸(jian)揮發(fa)而(er)膠變(bian)濃時可(ke)適當(dang)加入(ru)壹(yi)些(xie)丙酮(tong)。
    5、 間質(zhi)著(zhe)色(se)
    著(zhe)色(se)部位(wei)主要(yao)在間(jian)質(zhi)，間(jian)質(zhi)著(zhe)色(se)的(de)原(yuan)因(yin)很(hen)多，如抗(kang)體(ti)與組織中(zhong)的蛋(dan)白質(zhi)因(yin)蛋(dan)白疏(shu)水基(ji)團(tuan)相(xiang)互(hu)作用形(xing)成非特異(yi)性的(de)連(lian)接而著(zhe)色(se)，加壹(yi)抗(kang)前(qian)的清(qing)封(feng)閉(bi)這壹(yi)步(bu)就(jiu)是(shi)為(wei)了避(bi)免非特(te)異(yi)型(xing)的(de)結(jie)合(he)。又如清(qing)中(zhong)的免疫球蛋白常常滲(shen)出(chu)到(dao)組織間質(zhi)，很(hen)容(rong)易(yi)與抗(kang)體(ti)結合(he)，造成間質(zhi)著(zhe)色(se)，特(te)別(bie)是(shi)lambda和(he)kappa染(ran)色(se)時(shi)。當(dang)甲狀腺膠質(zhi)外(wai)溢(yi)到(dao)組織間質(zhi)時(shi)，做甲狀腺球蛋白染色也會(hui)出(chu)現(xian)間質(zhi)著(zhe)色(se)。抗(kang)體(ti)不(bu)純(chun)或(huo)抗(kang)體(ti)被汙(wu)染(ran)也(ye)可出(chu)現(xian)間質(zhi)著(zhe)色(se)，我(wo)們(men)曾遇到(dao)CD20抗(kang)體(ti)不(bu)純(chun)，除(chu)了(le)染(ran)上(shang)B細胞外(wai)還染上了(le)間質(zhi)。
    6、 細(xi)胞(bao)漿(jiang)著色(se)
    胞漿(jiang)著色(se)是(shi)所有(you)“雜音(yin)”染(ran)色(se)中(zhong)有(you)欺(qi)騙性的(de)著色，著色區(qu)局限在細(xi)胞(bao)內(nei)，間(jian)質(zhi)無(wu)著(zhe)色(se)，看(kan)上去與(yu)真實的(de)免疫反應著(zhe)色(se)幾(ji)乎壹(yi)樣(yang)，很難(nan)區(qu)別。胞(bao)漿(jiang)裏含有(you)較多的蛋(dan)白質(zhi)，因(yin)此(ci)，很(hen)多非特(te)異(yi)性的(de)染色除(chu)了(le)見(jian)於(yu)間(jian)質(zhi)也(ye)可(ke)以出(chu)現(xian)在胞(bao)漿(jiang)中(zhong)。這種(zhong)原(yuan)因(yin)造(zao)成的著色，可(ke)以通過(guo)清(qing)封(feng)閉(bi)解決(jue)。還有(you)因(yin)內(nei)源(yuan)酶造成的著色，如血(xue)紅蛋(dan)白（紅細(xi)胞）、肌紅蛋(dan)白（肌細胞）、細(xi)胞(bao)色(se)素(su)（粒(li)細胞(bao)、單(dan)核細(xi)胞(bao)）、過氧化(hua)氫(qing)酶(mei)（肝(gan)、腎(shen)），這(zhe)些(xie)可用過(guo)氧化(hua)氫(qing)進(jin)行封(feng)閉(bi)。巨噬細(xi)胞(bao)吞(tun)噬各種(zhong)抗(kang)原(yuan)物(wu)質(zhi)或(huo)Fc片斷(duan)而(er)出(chu)現(xian)胞漿(jiang)著色(se)，這種(zhong)著色不(bu)易(yi)避免，但可以通過(guo)形(xing)態學辨認(ren)出(chu)巨(ju)噬細(xi)胞(bao)而引起重視(shi)。內(nei)源(yuan)性的(de)著色有(you)欺(qi)騙性，因(yin)為(wei)它廣(guang)泛(fan)的存(cun)在於(yu)組織細胞中(zhong)，我們(men)研究結果顯(xian)示(shi)：冰凍(dong)組織中(zhong)存(cun)在內(nei)源(yuan)性，經(jing)福(fu)馬(ma)林固定(ding)石(shi)蠟(la)包埋(mai)後被封(feng)閉(bi)，加熱抗(kang)原(yuan)修(xiu)復(fu)後造成內(nei)源(yuan)性暴露(lu)，內(nei)源(yuan)性暴露(lu)的(de)強(qiang)度在不(bu)同(tong)的組織有(you)所不(bu)同(tong)，免疫從(cong)弱(ruo)陽性（+）到(dao)強(qiang)陽性（+++），內(nei)源(yuan)性在組織中(zhong)的分(fen)布形(xing)式，既有(you)散(san)在分(fen)布(bu)也有(you)彌(mi)漫分(fen)布(bu)，主要以顆粒(li)狀形(xing)式存(cun)在於(yu)胞(bao)漿(jiang)中(zhong)，內(nei)源(yuan)性廣(guang)泛(fan)存(cun)在於(yu)上(shang)皮(pi)源性組織，特別是(shi)腺上皮組織，亦存(cun)在部分非(fei)上皮組織，內(nei)源(yuan)性不(bu)僅存(cun)在人(ren)體(ti)組織也存(cun)在大(da)鼠組織，內(nei)源(yuan)性暴露(lu)的(de)強(qiang)弱與(yu)修復(fu)液有(you)關(guan)，其(qi)強(qiang)度增(zeng)加依(yi)次(ci)為(wei)：檸(ning)檬(meng)酸(suan)、EDTA、EGTA，熱抗(kang)原(yuan)修(xiu)復(fu)暴露(lu)的(de)內(nei)源(yuan)性可(ke)被雞蛋(dan)清封(feng)閉(bi)，非檢(jian)測系(xi)統(tong)Polymer兩(liang)步(bu)法（EliVision、EnVision）可(ke)避(bi)免幹擾(rao)。
    7、 細胞核著(zhe)色(se)
    不(bu)適當(dang)的組織處理(li)可以出(chu)現(xian)細胞核著(zhe)色(se)，如組織在二(er)甲苯(ben)裏浸泡時間(jian)太(tai)長（如從(cong)星期(qi)五(wu)浸泡到(dao)下星期(qi)壹）、緩沖(chong)液(ye)中(zhong)浸泡時間(jian)太(tai)長、組織變幹、微波(bo)修復(fu)液的pH值和修復(fu)時間不(bu)當(dang)或(huo)修復(fu)過程中(zhong)修復(fu)液留下得(de)太(tai)少，未沒(mei)過組織等。解決(jue)辦法是(shi)嚴(yan)格按(an)照操(cao)作常規進(jin)行工作(zuo)。

二(er)、 無色(se)片
    染(ran)色(se)結束(shu)後，切(qie)片中(zhong)見不(bu)到(dao)任(ren)何(he)陽性信(xin)號。這是(shi)常規工作(zuo)中(zhong)比較常見的(de)現(xian)象，出(chu)現(xian)這種(zhong)現象，有(you)兩(liang)種(zhong)可能(neng)：、真(zhen)陰性結(jie)果：整(zheng)個(ge)染(ran)色(se)過(guo)程沒(mei)有(you)出(chu)現(xian)問題，組織或(huo)細胞(bao)確(que)實不(bu)表(biao)達與(yu)抗(kang)體(ti)相關(guan)的(de)抗(kang)原(yuan)。2、假(jia)陰(yin)性結(jie)果：即此陰(yin)性結(jie)果不(bu)是(shi)真(zhen)實的(de)反映。假(jia)陰(yin)性結(jie)果又(you)可(ke)分為(wei)兩種(zhong)情況：（）、切(qie)片中(zhong)根本(ben)就不(bu)包(bao)含所預(yu)期檢(jian)查(zha)的(de)組織或(huo)細胞(bao)。出(chu)現(xian)這種(zhong)情況，要(yao)麼(me)是(shi)病(bing)理(li)醫生選擇錯了(le)切(qie)片或(huo)抗(kang)體(ti)選錯(cuo)了(le)，要麼(me)是(shi)技術(shu)員選錯(cuo)了(le)蠟(la)塊。獲得(de)正(zheng)確(que)的切(qie)片進(jin)行染(ran)色(se)是(shi)獲得(de)正(zheng)確(que)結果的(de)前(qian)提。由此表明(ming)：制(zhi)作(zuo)出(chu)合(he)格的(de)免疫組化(hua)切(qie)片不(bu)僅僅是(shi)技術(shu)員的(de)事(shi)，病理(li)醫生也(ye)起著*的(de)作用。（2）、染(ran)色(se)過(guo)程中(zhong)的某(mou)壹或(huo)某些(xie)環(huan)節出(chu)了(le)問題。比如，組織未進(jin)行抗(kang)原(yuan)修(xiu)復(fu)，有(you)的(de)組織必須經(jing)過(guo)抗(kang)原(yuan)修(xiu)復(fu)才能(neng)檢(jian)測抗(kang)原(yuan)表(biao)達(da)；或(huo)選用了(le)只(zhi)能(neng)用於(yu)冰(bing)凍(dong)組織而不(bu)能(neng)用於(yu)石(shi)蠟(la)包埋(mai)組織的抗(kang)體(ti)；或(huo)壹抗(kang)失(shi)效(xiao)，雖(sui)然(ran)抗(kang)體(ti)失(shi)效(xiao)在理(li)論上(shang)是(shi)壹(yi)個(ge)逐(zhu)漸(jian)的(de)過(guo)程，但偶爾(er)也遇(yu)到(dao)突(tu)然(ran)失(shi)效(xiao)的(de)情(qing)況，抗(kang)體(ti)不(bu)用和(he)/或(huo)已超(chao)過有(you)效(xiao)期是(shi)主(zhu)要(yao)的(de)原(yuan)因(yin)。也(ye)可(ke)見於(yu)染(ran)色(se)過程中(zhong)漏掉了某壹環(huan)節，如忘(wang)記加二(er)抗(kang)或(huo)三抗(kang)，或(huo)用了(le)兩(liang)次(ci)二(er)抗(kang)而(er)缺少(shao)了(le)三抗(kang)，或(huo)配(pei)制(zhi)DAB時(shi)少了過氧化(hua)氫(qing)。為(wei)了避(bi)免這種(zhong)簡(jian)單(dan)的錯(cuo)誤(wu)，有(you)壹(yi)種(zhong)簡(jian)單(dan)的方(fang)法：在三抗(kang)孵(fu)育結(jie)束(shu)時(shi)，將切(qie)片上(shang)的(de)三抗(kang)甩在壹(yi)張白紙上，在將配(pei)制(zhi)好(hao)的DAB滴(di)壹(yi)滴(di)在白紙的三抗(kang)上(shang)，觀(guan)察是(shi)否(fou)出(chu)現(xian)棕色。如果出(chu)現(xian)了，證(zheng)明(ming)三抗(kang)和(he)DAB的配(pei)制(zhi)過(guo)程沒(mei)有(you)錯(cuo)誤。如果這(zhe)種(zhong)DAB再滴(di)到(dao)切(qie)片上(shang)沒(mei)有(you)出(chu)現(xian)任何(he)陽性信(xin)號，問題壹定(ding)是(shi)出(chu)在三抗(kang)以前。如果紙(zhi)上(shang)不(bu)出(chu)現(xian)棕色反應，問(wen)題(ti)肯定(ding)在三抗(kang)DAB或(huo)DAB的配(pei)制(zhi)過(guo)程。這(zhe)種(zhong)簡(jian)單(dan)方(fang)法能(neng)迅(xun)速的幫助(zhu)我們(men)查(zha)找(zhao)出(chu)現(xian)問題可能(neng)的(de)原(yuan)因(yin)。
    解決(jue)陰性染(ran)色的問題非(fei)常簡(jian)單(dan)，就是(shi)設(she)立(li)“陽性對(dui)照”。如果陽(yang)性對(dui)照有(you)了(le)表達，說(shuo)明(ming)染(ran)色(se)的全過程和(he)所有(you)試劑(ji)都(dou)沒(mei)有(you)問(wen)題。如果此(ci)時(shi)測試片仍(reng)為(wei)陰性，便是(shi)真(zhen)實的(de)陰(yin)性，說(shuo)明(ming)組織或(huo)細胞(bao)沒(mei)有(you)相(xiang)應的抗(kang)原(yuan)表(biao)達(da)。反之，如果陽(yang)性對(dui)照沒(mei)有(you)著(zhe)色，表明染(ran)色(se)過(guo)程中(zhong)某個(ge)或(huo)某些(xie)步(bu)驟出(chu)了(le)問題或(huo)試劑(ji)出(chu)了(le)問題。應壹(yi)壹(yi)尋找(zhao)原(yuan)因(yin)。陽(yang)性對(dui)照包括(kuo)兩(liang)種(zhong)，壹種(zhong)稱為(wei)“自身對照(zhao)”或(huo)“內(nei)部對照(zhao)”，這是(shi)指在測試的切(qie)片中(zhong)本(ben)身就存(cun)在已(yi)知(zhi)的(de)抗(kang)原(yuan)，如正(zheng)常淋巴(ba)結中(zhong)存(cun)在T和(he)B細(xi)胞抗(kang)原(yuan)，CD20或(huo)CD3都應(ying)該有(you)表(biao)達。自身對照(zhao)是(shi)壹(yi)種(zhong)比較理(li)想的(de)對照(zhao)，對照和(he)測試組織或(huo)細胞(bao)都在同(tong)壹張切(qie)片中(zhong)，都處於(yu)相(xiang)同(tong)的試驗(yan)條件(jian)下，結(jie)果更可(ke)靠(kao)也更具(ju)有(you)可(ke)比性。在選擇自身對照(zhao)片時(shi)選擇既變(bian)組織同(tong)時又(you)有(you)正(zheng)常組織的部分，這(zhe)樣(yang)有(you)利於(yu)對(dui)比(bi)。另壹(yi)種(zhong)稱為(wei)“外(wai)部對照(zhao)”，有(you)時(shi)在測試的切(qie)片中(zhong)不(bu)存(cun)在已(yi)知(zhi)的(de)抗(kang)原(yuan)，如在胃的標本(ben)中(zhong)懷(huai)疑是(shi)惡性黑(hei)色(se)素(su)瘤(liu)，需(xu)要用HMB45或(huo)Mart-來檢(jian)測，在正(zheng)常的胃組織中(zhong)本(ben)身不(bu)存(cun)在相(xiang)關(guan)的(de)抗(kang)原(yuan)，如果病(bing)變(bian)出(chu)現(xian)陽性反應結(jie)果，尚能(neng)提示是(shi)惡黑(hei)，但是(shi)如果出(chu)現(xian)陰性結(jie)果，就(jiu)無(wu)法確(que)定(ding)是(shi)本(ben)身組織中(zhong)不(bu)含黑(hei)色(se)素(su)瘤(liu)抗(kang)原(yuan)，還(hai)是(shi)技術(shu)問(wen)題(ti)。因此，應(ying)另外(wai)設(she)立(li)壹個(ge)已知(zhi)的(de)陽性對(dui)照。這種(zhong)在測試組織之外(wai)的陽性對(dui)照稱為(wei)“外(wai)部對照(zhao)”。在實際(ji)工作(zuo)中(zhong)需(xu)要設(she)立(li)外(wai)部對照(zhao)的情況(kuang)很多，如果每(mei)壹(yi)種(zhong)抗(kang)體(ti)都要選不(bu)同(tong)的陽(yang)性對(dui)照，工作(zuo)量會很大(da)。為(wei)了解決(jue)這個(ge)問題(ti)，目前國內(nei)外(wai)有(you)單(dan)位(wei)將多種(zhong)不(bu)同(tong)組織集(ji)成在壹(yi)起，制(zhi)成多組織切(qie)片、“臘(la)腸(chang)”“春卷(juan)”切(qie)片、組織芯(xin)片等，其(qi)連(lian)續切(qie)片儲(chu)備(bei)待(dai)用，需(xu)要時(shi)取出(chu)壹(yi)張便可作(zuo)為(wei)陽性對(dui)照。另外(wai)，比較簡(jian)單(dan)的方(fang)法，是(shi)采(cai)用闌(lan)尾作(zuo)為(wei)陽性對(dui)照，因為(wei)與人(ren)體(ti)其它組織器官(guan)比較闌尾包(bao)含的(de)組織種(zhong)類較多，如有(you)上(shang)皮、淋巴(ba)組織、平滑肌、間質(zhi)、神(shen)經(jing)、管(guan)、間(jian)皮(pi)等。壹(yi)張闌尾切(qie)片可(ke)以檢(jian)測大(da)多數常用的(de)抗(kang)體(ti)。
    設(she)立(li)陽性對(dui)照是(shi)病(bing)理(li)醫生的(de)任(ren)務或(huo)責任(ren)，而不(bu)是(shi)技術(shu)員的(de)責(ze)任。病(bing)理(li)醫生觀(guan)察了HE切(qie)片，了(le)解切(qie)片中(zhong)是(shi)否(fou)有(you)自(zi)身對照(zhao)，如果沒(mei)有(you)，就(jiu)應告(gao)訴(su)技術(shu)員采(cai)用陽(yang)性對(dui)照。因此，病理(li)醫生在免疫組化(hua)中(zhong)的作(zuo)用是(shi)不(bu)可(ke)忽視(shi)的(de)。
抗(kang)體(ti)未覆(fu)蓋上測試組織：當(dang)多塊散(san)開的(de)小(xiao)組織染色時，可能(neng)漏掉某塊組織染色。