酵母(mu)雙(shuang)雜(za)交實驗(yan)常見問題(ti)分(fen)析及處(chu)理方(fang)法

酵母(mu)雙(shuang)雜(za)交實驗(yan)常見問題(ti)分(fen)析及處(chu)理方(fang)法

在某(mou)些情況下，國產(chan)ELISA試劑盒(he)在液體(ti)培(pei)養(yang)基(ji)中培養(yang)不(bu)好(hao)的(de)菌(jun)珠可(ke)以(yi)在固體(ti)培(pei)養(yang)基(ji)上生長(chang)得很(hen)好(hao)。首先重懸(xuan)克(ke)隆於(yu)ml的SD/–Trp，接(jie)著(zhe)將(jiang)重(zhong)懸(xuan)液平(ping)鋪於(yu)5 個00-mm的SD/–Trp平板(ban)，在30℃下溫浴，直至(zhi)平板(ban)上的(de)克(ke)隆相互(hu)粘在壹起(qi)。用5ml 0.5X YPDA刮下每塊板(ban)上的(de)克(ke)隆，並(bing)收集(ji)到(dao)壹管中，這樣就可(ke)以(yi)使用這(zhe)個(ge)細(xi)胞(bao)重懸(xuan)液進(jin)行正常的雜交反(fan)應(ying)。

如果誘(you)餌(er)蛋白能直(zhi)接(jie)激(ji)活報告基因的(de)表(biao)達，該如何處理?

該蛋白很(hen)可(ke)能有(you)轉錄(lu)激(ji)活域，是個轉錄(lu)因(yin)子(zi)。可(ke)以(yi)通(tong)過基因重(zhong)組(zu)切(qie)掉轉錄(lu)激(ji)活域，然(ran)後重新(xin)檢(jian)測其是否(fou)自(zi)激(ji)活，但(dan)要註(zhu)意重組(zu)也有(you)可(ke)能破(po)壞蛋白之間的互作(zuo)。

轉化效(xiao)率(lv)太(tai)低怎麽(me)辦?

可(ke)以(yi)采(cai)用(yong)以(yi)下方法解(jie)決：

)國產ELISA試(shi)劑盒(he)檢(jian)測壹下DNA的純(chun)度，如果(guo)可(ke)以(yi)的話(hua)，重(zhong)新用乙醇純(chun)化。

2)DNA-BD/誘(you)餌(er)蛋白很(hen)可(ke)能是有毒的。

3)不(bu)適(shi)當的(de)培(pei)養基(ji)，重新配制培養(yang)基，並(bing)做對(dui)照(zhao)轉化。

4)檢(jian)測pGBT9對(dui)照(zhao)載(zai)體(ti)的(de)轉化效(xiao)率(lv)，放置於(yu)SD/–Trp平板(ban)上，轉化效(xiao)率(lv)應該在 x05 colonies/mg DNA以上(shang)。

雜(za)交效(xiao)率(lv)不(bu)高，該如何處理?

在雜交(jiao)中，預(yu)轉化的(de)誘(you)餌(er)細胞(bao)的數(shu)量可(ke)能不(bu)夠。當對(dui)誘(you)餌(er)菌株(zhu)進行液體(ti)培(pei)養(yang)過夜(ye)時，應(ying)挑(tiao)選(xuan)大的(de)、新(xin)鮮(xian)的(de)克(ke)隆進行培(pei)養(yang)，經(jing)過離(li)心(xin)和重(zhong)懸(xuan)後，再使(shi)用(yong)血球計(ji)對(dui)細(xi)胞(bao)進行計(ji)數。密(mi)度(du)應(ying)該在 x09/ml。

壹個(ge)甚至(zhi)兩(liang)個(ge)融合(he)蛋白對(dui)酵(jiao)母(mu)細胞(bao)有毒(du)。妳可(ke)以(yi)通(tong)過重組(zu)方(fang)法來(lai)減輕毒(du)性，同時又(you)能保(bao)證蛋白的(de)相互(hu)作(zuo)用。或(huo)者(zhe)使(shi)用(yong)表達(da)水(shui)平(ping)較(jiao)低(di)的(de)載(zai)體(ti)。國(guo)產(chan)ELISA試(shi)劑盒(he)也可(ke)以(yi)在瓊脂(zhi)平板(ban)或(huo)濾膜上進行雜(za)交(jiao)。但(dan)同時必(bi)須作(zuo)雜交(jiao)對(dui)照(zhao)實(shi)驗。