國(guo)產ELISA試劑盒(he)的概(gai)念(nian)、原(yuan)理(li)、操(cao)作步(bu)驟(zhou)

國(guo)產ELISA試劑盒(he)是(shi)酶(mei)聯(lian)接(jie)免(mian)疫吸附(fu)劑測定（ Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ）的簡(jian)稱。它是(shi)繼(ji)免疫熒(ying)光和放射(she)免疫(yi)技術之後發(fa)展(zhan)起(qi)來(lai)的壹種(zhong)免(mian)疫酶(mei)技術。此項(xiang)技術自70年(nian)代初(chu)問(wen)世(shi)以來(lai)，發(fa)展(zhan)十(shi)分(fen)迅速，目(mu)前(qian)已(yi)被廣(guang)泛用於(yu)生(sheng)物(wu)學(xue)和(he)醫(yi)學(xue)科(ke)學(xue)的許(xu)多領域(yu)。
（壹(yi)） 原理(li)
ELISA是以免(mian)疫(yi)學(xue)反(fan)應(ying)為(wei)基(ji)礎，將(jiang)抗(kang)原(yuan)、牽9體(ti)的特異性反(fan)應(ying)與酶(mei)對(dui)底物(wu)的催(cui)化(hua)作用相結(jie)合起(qi)來(lai)的壹種(zhong)敏(min)感性很高的試驗技術。由(you)於(yu)抗(kang)原(yuan)、抗(kang)體(ti)的反(fan)應(ying)在壹(yi)種(zhong)固(gu)相載(zai)體(ti)──聚苯乙(yi)烯微(wei)量(liang)滴(di)定(ding)板的孔中(zhong)進(jin)行(xing)，每(mei)加(jia)入壹種(zhong)試劑孵育(yu)後，可通過(guo)洗滌除(chu)去多余的遊離(li)反(fan)應(ying)物，從(cong)而保證試驗結(jie)果(guo)的特異性與穩(wen)定性(xing)。在實(shi)際應用中，通(tong)過不(bu)同(tong)的設計(ji)，具體(ti)的方法步驟(zhou)可有(you)多種(zhong)。即:用於(yu)檢測抗體(ti)的間接(jie)法、用於(yu)檢測抗原(yuan)的雙(shuang)抗體(ti)夾心法以及用於(yu)檢測小分(fen)子(zi)抗原或(huo)半抗(kang)原(yuan)的抗原(yuan)競(jing)爭(zheng)法等(deng)等(deng)。比(bi)較常(chang)用的是國(guo)產ELISA試劑盒(he)雙(shuang)抗體(ti)夾心法及ELISA間接(jie)法。
（二） 操(cao)作步(bu)驟(zhou)
方(fang)法壹 用於(yu)檢測未知(zhi)抗原的雙(shuang)抗體(ti)夾心法:
. 包被(bei)：用0.05M PH9.牰(牰)碳酸(suan)鹽(yan)包(bao)被(bei)緩沖(chong)液(ye)將(jiang)抗(kang)體(ti)稀釋至蛋(dan)白質含(han)量(liang)為(wei)～0μg/ml。在每(mei)個聚(ju)苯乙(yi)烯板的反(fan)應(ying)孔中(zhong)加(jia)0.ml，4℃**。次(ci)日(ri)，棄(qi)去孔內(nei)溶(rong)液(ye)，用洗滌緩沖(chong)液(ye)洗3次(ci)，每(mei)次(ci)3分(fen)鐘。（簡(jian)稱洗滌，下(xia)同(tong)）。
2. 加(jia)樣(yang)：加(jia)壹定(ding)稀釋的待檢樣(yang)品(pin)0.ml於(yu)上(shang)述已包(bao)被(bei)之反(fan)應(ying)孔中(zhong)，置(zhi)37℃孵育(yu)小(xiao)時(shi)。然(ran)後洗滌。（同(tong)時(shi)做空(kong)白(bai)孔，陰(yin)性(xing)對(dui)照孔及陽性對(dui)照孔）。
3. 加(jia)酶(mei)標抗體(ti)：於(yu)各(ge)反(fan)應(ying)孔中(zhong)，加(jia)入新鮮(xian)稀釋的酶(mei)標抗體(ti)（經滴(di)定(ding)後的稀釋度(du)）0.ml。37℃孵育(yu)0.5～小(xiao)時(shi)，洗滌。
4. 加(jia)底物(wu)液顯色：於(yu)各(ge)反(fan)應(ying)孔中(zhong)加(jia)入臨(lin)時(shi)配(pei)制(zhi)的TMB底物(wu)溶(rong)液0.ml，37℃0～30分(fen)鐘。
5. 終(zhong)止(zhi)反(fan)應(ying)：於(yu)各(ge)反(fan)應(ying)孔中(zhong)加(jia)入2M硫酸(suan)0.05ml。
6. 結(jie)果(guo)判定(ding)：可於(yu)白(bai)色(se)背(bei)景(jing)上，直接用肉眼(yan)觀(guan)察結(jie)果(guo)：反(fan)應(ying)孔內(nei)顏(yan)色(se)越(yue)深(shen)，陽性程(cheng)度(du)越(yue)強，陰(yin)性(xing)反(fan)應(ying)為(wei)無(wu)色或(huo)極淺，依據所(suo)呈(cheng)顏(yan)色(se)的深淺(qian)，以“+”、“-”號(hao)表(biao)示。也(ye)可測O·D值：在ELISA檢測儀上(shang)，國(guo)產ELISA試劑盒(he)於(yu)450nm（若以ABTS顯色，則(ze)40nm）處(chu)，以空(kong)白(bai)對(dui)照孔調(tiao)零(ling)後測各(ge)孔O·D值，若大(da)於(yu)規(gui)定(ding)的陰(yin)性(xing)對(dui)照OD值的2.倍，即為(wei)陽性。