進口(kou)細胞(bao)株(zhu)蛋白(bai)的作(zuo)用以(yi)及(ji)相互(hu)作(zuo)用分(fen)析(xi)

　　進口(kou)細胞(bao)株(zhu)蛋白(bai)（Cytoglobin,Cygb）是(shi)壹(yi)種細(xi)胞(bao)內(nei)抗(kang)氧(yang)化(hua)蛋(dan)白(bai)，是(shi)近發現(xian)的脊椎動(dong)物珠蛋(dan)白(bai)超家族中的壹(yi)員，它(ta)具有保護(hu)細胞(bao)、抑制(zhi)腫瘤(liu)細胞(bao)增長(chang)的功(gong)能(neng)。進行酵母雙(shuang)雜(za)交(jiao)文(wen)庫(ku)構(gou)建(jian)，篩選(xuan)出與(yu)CYGB相互(hu)作(zuo)用的蛋(dan)白(bai)，為進(jin)壹(yi)步研究(jiu)CYGB的功(gong)能(neng)機制奠(dian)定(ding)基礎。酵(jiao)母(mu)雙(shuang)雜(za)交(jiao)文(wen)庫(ku)構(gou)建(jian)是(shi)篩庫(ku)的前(qian)提(ti)，可用於(yu)目(mu)的蛋(dan)白(bai)的互(hu)作(zuo)蛋白(bai)大規(gui)模(mo)篩(shai)選(xuan)分析(xi)蛋白(bai)質間(jian)的相互(hu)作(zuo)用，是(shi)現(xian)在分(fen)子(zi)生(sheng)物學(xue)與(yu)生(sheng)物化(hua)學(xue)常用的手(shou)段(duan)。
酵母(mu)雙(shuang)雜(za)交(jiao)技術(shu)是(shi)壹(yi)種具有很高靈敏(min)度(du)的研(yan)究(jiu)蛋白(bai)質之(zhi)間(jian)關(guan)系的技術(shu)，大(da)的優(you)點就是(shi)不(bu)需要(yao)分離(li)純(chun)化(hua)蛋白(bai)質，整個(ge)過(guo)程只(zhi)是(shi)對核(he)酸進(jin)行操作，同(tong)時(shi)充分利用酵(jiao)母(mu)生(sheng)長(chang)速度快(kuai)、易(yi)於操(cao)作等特(te)點，酵母(mu)雙(shuang)雜(za)交(jiao)文(wen)庫(ku)構(gou)建(jian)壹(yi)般(ban)包(bao)括(kuo)核(he)體系和(he)膜(mo)體(ti)系兩(liang)種(zhong)方法。美迪西(xi)提(ti)供(gong)酵(jiao)母雙(shuang)雜(za)交(jiao)服(fu)務(wu)，具有獨立實驗(yan)室，專業實(shi)驗(yan)人員，提(ti)供(gong)詳(xiang)細的酵(jiao)母(mu)雙(shuang)雜(za)交(jiao)實(shi)驗步驟、原(yuan)始(shi)數(shu)據(ju)和(he)圖片、結(jie)果(guo)分析(xi)，可以(yi)出(chu)具檢(jian)測數(shu)據(ju)報告(gao)。
進(jin)口(kou)細胞(bao)株(zhu)蛋白(bai)初由(you)日(ri)本Tawada等在200年(nian)在(zai)大(da)鼠(shu)纖維(wei)化(hua)肝臟(zang)的星狀細胞(bao)中發現(xian)了此種蛋白(bai)。由於(yu)其具有緊(jin)湊(cou)的螺(luo)旋(xuan)形結構和(he)結(jie)合(he)血(xue)紅素的能(neng)力，可可逆(ni)的結(jie)合(he)各(ge)類氣體(ti)分子，如氧(yang)氣、壹(yi)氧(yang)化(hua)氮(dan)等。Cygb在缺(que)氧(yang)時(shi)表(biao)達(da)上調且特(te)定(ding)地(di)表(biao)達(da)在毛細(xi)血(xue)管周(zhou)圍，提(ti)示其可能(neng)具有氧(yang)感(gan)受(shou)器(qi)的作(zuo)用。Cybd可以(yi)作(zuo)為清道(dao)夫(fu)，清除(chu)組(zu)織缺(que)血(xue)後再(zai)灌註時(shi)產(chan)生(sheng)的ROS和(he)NO分(fen)子(zi)。此(ci)外它(ta)還具有過氧(yang)化(hua)氫酶活(huo)性，在肝星狀細胞(bao)中其過氧(yang)化(hua)物(wu)清除(chu)劑的作(zuo)用。研(yan)究(jiu)顯示，Cygb對肝纖維(wei)化(hua)的逆(ni)轉有著(zhe)非常(chang)顯著的作(zuo)用。
Cygb具有預防肝纖維(wei)化(hua)、實現(xian)肝纖維(wei)化(hua)逆(ni)轉的功(gong)能(neng)，且其作用是(shi)通過(guo)調控HSC的激(ji)活(huo)狀態實(shi)現(xian)的，與(yu)肝臟(zang)中(zhong)細胞(bao)及細(xi)胞(bao)外基質間(jian)的氧(yang)化(hua)應(ying)激(ji)密切(qie)相關(guan)。有研究(jiu)者選(xuan)取了兩(liang)種(zhong)肝臟(zang)中(zhong)有代(dai)表性的氧(yang)化(hua)模(mo)型，過氧(yang)化(hua)氫模型及鐵(tie)過載(zai)模(mo)型，系統性研究(jiu)了Cygb在肝纖維(wei)化(hua)氧(yang)化(hua)應(ying)激(ji)中發揮(hui)的具體(ti)作(zuo)用，並(bing)結(jie)合microRNA(miRNA)技術(shu)，初(chu)步探索(suo)了Cygb在肝星狀細胞(bao)激(ji)活(huo)時表達(da)上調的可能(neng)性機制。該(gai)研究為全(quan)面闡(chan)釋Cygb這(zhe)壹(yi)治療基因的抗(kang)氧(yang)化(hua)作(zuo)用及(ji)機制、加速藥(yao)物新(xin)靶(ba)點開發提(ti)供(gong)了理論依據(ju)。
有研究(jiu)者通(tong)過(guo)酵(jiao)母(mu)雙(shuang)雜(za)交(jiao)篩(shai)選(xuan)出7個(ge)與(yu)Cygb相互(hu)作(zuo)用的蛋(dan)白(bai)，環指蛋白(bai)2(RNF2)是(shi)其中之壹(yi)，為進(jin)壹(yi)步研究(jiu)Cygb的功(gong)能(neng)機制奠(dian)定(ding)基礎。首先進行酵母雙(shuang)雜(za)交(jiao)文(wen)庫(ku)構(gou)建(jian)，篩選(xuan)Mate&PlateTMLibrary-UniversalHuman(Normalized)人源(yuan)標準化cDNA文(wen)庫(ku)，尋(xun)找(zhao)與Cygb相互(hu)作(zuo)用的蛋(dan)白(bai)，然後研究(jiu)者通(tong)過(guo)酵(jiao)母(mu)回復性雜(za)交(jiao)實(shi)驗和(he)免(mian)疫(yi)共(gong)沈澱實(shi)驗進壹(yi)步驗證(zheng)Cygb與(yu)RNF2之間的相互(hu)作(zuo)用。
環指蛋白(bai)2(RNF2)屬(shu)於(yu)多(duo)梳家族，是(shi)多梳(shu)抑(yi)制(zhi)復合(he)物(wu)(PRC)中的壹(yi)員。RNF2可以(yi)介(jie)導(dao)組(zu)蛋白(bai)H2A的泛(fan)素化(hua)，因(yin)此(ci)RNF2在(zai)多梳結構(gou)介(jie)導(dao)的基因抑(yi)制(zhi)中發揮(hui)重要(yao)作用。RNF2作(zuo)為(wei)PRC家族的壹(yi)員，在(zai)胃癌(ai)、結腸(chang)癌(ai)、淋巴(ba)癌(ai)等多種(zhong)癌(ai)癥中(zhong)高表達(da)。RNF2具有原癌(ai)基因的活(huo)性，敲(qiao)除(chu)RNF2的HeLa細(xi)胞(bao)形態(tai)會(hui)發生(sheng)改(gai)變(bian)，,細胞(bao)增殖也(ye)會(hui)受(shou)到抑制(zhi)。RNF2是(shi)壹(yi)種E3連接(jie)酶，與(yu)P53具有直接(jie)的相互(hu)作(zuo)用，在(zai)人(ren)結腸(chang)癌(ai)HCT6細胞(bao)系中它可以(yi)以(yi)p53為(wei)靶(ba)點通過(guo)蛋白(bai)酶體(ti)途(tu)徑，促進(jin)p53的降(jiang)解(jie)，從(cong)而影響P53下遊(you)基因的表(biao)達(da)水(shui)平，以(yi)調節(jie)細(xi)胞(bao)周期(qi)和(he)細(xi)胞(bao)雕亡(wang)。
據(ju)此研(yan)究者(zhe)推測Cygb與RNF2之(zhi)間(jian)的相互(hu)作(zuo)用很(hen)可能(neng)與腫瘤(liu)的發生(sheng)發展(zhan)具有壹(yi)定的關(guan)聯(lian)性。該(gai)研究具有以(yi)下(xia)作用:
（）成(cheng)功(gong)構建(jian)了pGBKT7-Cygb重組(zu)表達(da)載體(ti)，該(gai)重組(zu)質粒(li)在(zai)Y2HGold酵(jiao)母菌株(zhu)成功(gong)表達(da)BD-Cygb-MYC融(rong)合蛋(dan)白(bai)，且Cygb誘(you)餌蛋白(bai)對Y2HGold酵(jiao)母(mu)細(xi)胞(bao)無(wu)毒性作用、無(wu)自(zi)激(ji)活(huo)活(huo)性。實驗(yan)結(jie)果表明(ming)，pGBKT7-Cygb酵母(mu)誘(you)餌表達(da)載體(ti)構建(jian)成功，可以(yi)用於(yu)文(wen)庫(ku)篩(shai)選(xuan)。
（2）以(yi)pGBKT7-Cygb重(zhong)組(zu)質粒(li)為(wei)誘(you)餌從(cong)Mate&PlateTMLibrary-UniversalHuman(Normalized)文(wen)庫(ku)中(zhong)篩(shai)選(xuan)CYGB的相互(hu)作(zuo)用蛋(dan)白(bai)，終(zhong)得到32個(ge)藍(lan)色的陽性克隆。陽性克隆質(zhi)粒(li)的PCR產(chan)物(wu)經(jing)測序鑒(jian)定(ding)、比(bi)對初(chu)步得到了7個(ge)細(xi)胞(bao)珠蛋(dan)白(bai)的相互(hu)作(zuo)用基因。其中RNF2、SLC7A3、ATPB這三個(ge)基因重(zhong)復出(chu)現(xian)多次(ci)。RNF2基因壹(yi)共(gong)重(zhong)復出(chu)現(xian)次，並(bing)且與癌(ai)癥相關(guan)，是(shi)研究(jiu)者(zhe)們(men)驗(yan)證(zheng)和(he)深(shen)入(ru)研究的重(zhong)點。
（3）經酵(jiao)母回(hui)復性雜(za)交(jiao)實(shi)驗證(zheng)明(ming)在酵母中(zhong)RNF2確(que)實(shi)能(neng)與Cygb發生(sheng)相互(hu)作(zuo)用。經(jing)免(mian)疫(yi)共(gong)沈澱實(shi)驗證(zheng)明(ming)RNF2和(he)Cygb在(zai)HEK293T細(xi)胞(bao)中發生(sheng)了相互(hu)作(zuo)用。
（4）在(zai)人(ren)結腸(chang)癌(ai)HCT6細胞(bao)中，Cygb過(guo)表達(da)可以(yi)提(ti)高RNF2的mRNA水(shui)平，降(jiang)低P53和(he)P2的mRNA水(shui)平。提(ti)示Cygb很(hen)可能(neng)正向(xiang)調控RNF2，從(cong)而影響腫瘤(liu)的發生(sheng)發展(zhan)。
通(tong)過(guo)酵(jiao)母(mu)雙(shuang)雜(za)交(jiao)系統篩(shai)選(xuan)出與(yu)進口(kou)細胞(bao)株(zhu)蛋白(bai)相互(hu)作(zuo)用蛋(dan)白(bai)的研(yan)究(jiu)，為進(jin)壹(yi)步加深(shen)對(dui)進口(kou)細胞(bao)株(zhu)蛋白(bai)生(sheng)物學(xue)功(gong)能(neng)的認(ren)識(shi)，和(he)為(wei)治(zhi)療肝纖維(wei)化(hua)等疾病(bing)提(ti)供(gong)堅(jian)實的理(li)論基礎。