弓形桿菌(jun)屬(shu)通用(yong)PCR檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒設(she)計(ji)引(yin)物(wu)原(yuan)則

弓形(xing)桿菌(jun)屬(shu)通用(yong)PCR檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒參(can)加(jia)PCR反(fan)應的物質主要(yao)有五(wu)種即引(yin)物(wu)、酶(mei)、dNTP、模板和(he)Mg2+

引物(wu)： 引物(wu)是PCR特異(yi)性反(fan)應的關(guan)鍵(jian)，PCR 產(chan)物(wu)的特異(yi)性取決於(yu)引物(wu)與模板DNA互(hu)補的程度。理(li)論上(shang)，只要(yao)知(zhi)道(dao)任何(he)壹(yi)段模板DNA序(xu)列(lie)，就能按其(qi)設(she)計(ji)互(hu)補的寡核苷酸(suan)鏈做(zuo)引(yin)物，利(li)用(yong)PCR就可將(jiang)模板DNA在(zai)體外(wai)大(da)量擴增(zeng)。

設(she)計(ji)引(yin)物(wu)應(ying)遵(zun)循(xun)以下原(yuan)則：

①引物長度： 5-30bp，常用(yong)為20bp左(zuo)右。

②引物擴增(zeng)跨(kua)度： 以200-500bp為宜(yi)，特定(ding)條(tiao)件下(xia)可擴(kuo)增(zeng)長至(zhi)0kb的片段。

③引物(wu)堿基：G+C含(han)量以40-60%為宜(yi)，G+C太少擴增(zeng)效果(guo)不佳(jia)，G+C過(guo)多(duo)易出(chu)現非特異(yi)條帶。ATGC好隨(sui)機分(fen)布，避(bi)免(mian)5個以上(shang)的嘌(piao)呤或嘧(mi)啶(ding)核苷酸(suan)的成(cheng)串(chuan)排(pai)列(lie)。

④避免(mian)引(yin)物(wu)內部出(chu)現二級(ji)結構，避免(mian)兩(liang)條(tiao)引(yin)物(wu)間互補，特別是3’端的互補，否則會形成(cheng)引(yin)物(wu)二(er)聚(ju)體，產(chan)生(sheng)非特異(yi)的擴增條帶(dai)。

⑤引(yin)物(wu)3’端的堿基，特別是zui末(mo)及(ji)倒數第二個堿基，應(ying)嚴格(ge)要(yao)求(qiu)配(pei)對，以避免(mian)因末(mo)端堿基不配(pei)對而導(dao)致PCR失敗(bai)。

⑥引(yin)物中有或能加(jia)上(shang)合(he)適的酶(mei)切位(wei)點(dian)，被(bei)擴增(zeng)的靶序(xu)列(lie)zui有適宜(yi)的酶(mei)切位(wei)點(dian)，這(zhe)對酶(mei)切分(fen)析或分(fen)子(zi)克隆(long)很(hen)有好處(chu)。

⑦引物(wu)的特異(yi)性：引(yin)物應(ying)與核(he)酸(suan)序(xu)列(lie)數(shu)據庫(ku)的其(qi)它(ta)序(xu)列(lie)無(wu)明顯(xian)同源(yuan)性。