埃博(bo)拉(la)病(bing)毒（EBOV）核酸檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒檢測常(chang)見(jian)問題(ti)

埃博(bo)拉(la)病(bing)毒(EBOV)核酸檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒檢測常(chang)見(jian)問題(ti)的(de)常見(jian)原因(yin)

. cDNA產量的(de)很(hen)低(di)可能的(de)原因(yin)：

) RNA模板質量低(di)

2) 對mRNA濃度估計過高

3)反應體(ti)系中存(cun)在(zai)反轉錄(lu)酶(mei)抑制劑(ji)或反轉錄(lu)酶(mei)量(liang)不足(zu)

4)同位素磷(lin)32過期

5)反(fan)應體(ti)積過大(da)，不應超(chao)過50μl

2. 擴(kuo)增產物在(zai)電泳分析時(shi)沒(mei)有(you)條(tiao)帶或條(tiao)帶很(hen)淺

)常見(jian)的(de)原因(yin)在於(yu)您(nin)的(de)反應體(ti)系是PCR的(de)反應體(ti)系而(er)不是(shi)RT-PCR的(de)反應體(ti)系

3) 與反(fan)應起始時(shi)RNA的(de)總量及(ji)純度(du)有關

4) 建(jian)議在試(shi)驗中加入對(dui)照RNA

5) 壹(yi)鏈(lian)的(de)反應產物在(zai)進(jin)行PCR擴(kuo)增時(shi)，在(zai)總的(de)反應體(ti)系中的(de)含量不要(yao)超(chao)過/0

6) 建(jian)議用(yong)Oligo(dT)或(huo)隨機引(yin)物代(dai)替基因(yin)特(te)異(yi)性引(yin)物（GSP）用(yong)於(yu)壹(yi)鏈(lian)合成(cheng)。由於(yu)RNA模板存(cun)在(zai)二(er)級結構，如環(huan)狀(zhuang)結(jie)果，有可(ke)能導致(zhi)GSP無(wu)法(fa)與(yu)模板退火；或SSⅡ反轉錄(lu)酶(mei)無(wu)法(fa)從此(ci)引物(wu)進(jin)行有(you)效(xiao)延伸(shen)。

7) 目(mu)的(de)mRNA中含有強的(de)轉錄(lu)中止位點，可以(yi)試(shi)用(yong)以(yi)下方法(fa)解(jie)決(jue)：

a. 將(jiang)壹(yi)鏈(lian)的(de)反應溫度(du)提高至(zhi)50℃。

b. 使用(yong)隨機六(liu)聚體(ti)代替Oligo(dT)進(jin)行壹(yi)鏈(lian)反應。

3. 產生非(fei)特(te)異(yi)性條(tiao)帶

)用(yong)RT陰(yin)性對(dui)照檢測(ce)是(shi)否(fou)被基因(yin)組DNA汙(wu)染(ran)。如果RT陰(yin)性對(dui)照的(de)PCR結果也顯示(shi)同(tong)樣(yang)條(tiao)帶，則需(xu)要(yao)用(yong)DNase I重(zhong)新(xin)處理(li)樣(yang)品(pin)。

2)在(zai)PCR反應中，非(fei)特(te)異(yi)的(de)起始擴(kuo)增將(jiang)導(dao)致(zhi)產生非(fei)特(te)異(yi)性結(jie)果。在低(di)於(yu)引(yin)物(wu)Tm 2至(zhi)5℃的(de)溫度(du)下進(jin)行退(tui)火，降(jiang)低(di)鎂(mei)離子或是目(mu)的(de)DNA的(de)量將減(jian)少非(fei)特(te)異(yi)性結(jie)果的(de)產生。

3)由(you)於(yu)mRNA剪切方式(shi)的(de)不同(tong)，根據(ju)選(xuan)擇(ze)引物(wu)的(de)不同(tong)將導致(zhi)產生不同(tong)的(de)RT-PCR結果。

4. 產生彌(mi)散（smear）條(tiao)帶

)在PCR反應體(ti)系中壹(yi)鏈(lian)產物的(de)含量過高

2)減(jian)少引(yin)物的(de)用(yong)量(liang)

3)優(you)化(hua)PCR反應條(tiao)件(jian)/減(jian)少PCR的(de)循環(huan)次(ci)數

4)在(zai)用(yong)DNase處(chu)理(li)被DNA汙(wu)染的(de)RNA樣(yang)品(pin)時(shi)，其產生的(de)寡(gua)核苷(gan)酸片段(duan)會產生非(fei)特(te)異(yi)性擴(kuo)增，壹(yi)般會顯示(shi)為彌(mi)散(san)背景(jing)。

5. 產生大(da)分子量的(de)彌散條(tiao)帶

)大(da)多(duo)數(shu)情(qing)況(kuang)下是由(you)於(yu)退(tui)火溫度(du)過低(di)而(er)導致的(de)非(fei)特(te)異(yi)性的(de)起始及(ji)延伸(shen)產生的(de)

2)對於(yu)長(chang)片段(duan)的(de)PCR，建(jian)議將反(fan)應體(ti)系中cDNA的(de)濃度稀釋(shi)至(zhi):0（或:00-:200）

6. 在(zai)無(wu)反轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)的(de)情況(kuang)下，對照RNA獲得(de)擴(kuo)增結(jie)果詳細解(jie)析關於(yu)Elisa試(shi)劑(ji)盒的(de)儲存(cun)於(yu)有(you)效(xiao)期多(duo)久(jiu)