柯薩(sa)奇(qi)病毒A24型PCR檢測試(shi)劑盒檢(jian)測方(fang)法

柯(ke)薩(sa)奇(qi)病毒A24型PCR檢測試(shi)劑盒檢(jian)測方(fang)法：​
.Ⅰ法：
在PCR反應體系中(zhong)，加入(ru)過量(liang)SYBR熒(ying)光(guang)染(ran)料，SYBR熒(ying)光(guang)染(ran)料特異(yi)性地(di)摻入(ru)DNA雙(shuang)鏈(lian)後，發射熒(ying)光(guang)信(xin)號，而不(bu)摻入(ru)鏈中(zhong)的SYBR染(ran)料分(fen)子(zi)不(bu)會(hui)發(fa)射任何熒(ying)光(guang)信(xin)號，從(cong)而保(bao)證熒(ying)光(guang)信(xin)號的增加與(yu)PCR產(chan)物的(de)增(zeng)加*同(tong)步。
定(ding)量(liang)PCR擴增熒(ying)光(guang)曲(qu)線圖
PCR產(chan)物熔(rong)解(jie)曲(qu)線圖
2.TaqMan探針(zhen)法(fa)：
探針(zhen)完(wan)整(zheng)時(shi)，報告(gao)基(ji)團發(fa)射的(de)熒(ying)光(guang)信(xin)號被(bei)淬(cui)滅基(ji)團吸(xi)收；PCR擴增時(shi)，Taq酶(mei)的5’-3’外切酶活(huo)性將(jiang)探針(zhen)酶(mei)切(qie)降(jiang)解(jie)，使報(bao)告(gao)熒(ying)光(guang)基(ji)團和(he)淬(cui)滅熒(ying)光(guang)基(ji)團分(fen)離(li)，從(cong)而熒(ying)光(guang)監測系(xi)統可接收到熒(ying)光(guang)信(xin)號，即每擴增(zeng)壹條DNA鏈，就(jiu)有壹個(ge)熒(ying)光(guang)分(fen)子(zi)形(xing)成(cheng)，實現了(le)熒(ying)光(guang)信(xin)號的累積(ji)與PCR產(chan)物的(de)形(xing)成(cheng)*同(tong)步。
取(qu)凍(dong)存(cun)已裂(lie)解(jie)的(de)細(xi)胞(bao)，室(shi)溫放置5分(fen)鐘使其(qi)*溶(rong)解(jie)。
②兩(liang)相分(fen)離(li) 每ml的(de)TRIZOL試劑(ji)裂(lie)解(jie)的(de)樣(yang)品(pin)中(zhong)加入(ru)0.2ml的(de)lvfang，蓋(gai)緊(jin)管(guan)蓋(gai)。手動(dong)劇烈振(zhen)蕩管(guan)體5秒(miao)後，5到30℃孵育2到3分(fen)鐘。4℃下2000rpm離(li)心5分(fen)鐘。離(li)心後混合液(ye)體將(jiang)分(fen)為(wei)下層(ceng)的(de)紅色(se)酚lvfang相，中(zhong)間層(ceng)以(yi)及無(wu)色(se)水相上(shang)層(ceng)。RNA全部(bu)被(bei)分(fen)配(pei)於水相中(zhong)。水相上(shang)層(ceng)的體積大(da)約是(shi)勻漿(jiang)時(shi)加入(ru)的(de)TRIZOL試(shi)劑的60%。
③RNA沈(chen)澱 將(jiang)水相上(shang)層(ceng)轉移(yi)到(dao)壹幹(gan)凈(jing)無(wu)RNA酶(mei)的離(li)心管(guan)中(zhong)。加等(deng)體積yibing醇(chun)混合以(yi)沈(chen)澱其(qi)中(zhong)的RNA，混(hun)勻後5到30℃孵育0分(fen)鐘後，於4℃下2000rpm 離(li)心0分(fen)鐘。此(ci)時(shi)離(li)心前(qian)不(bu)可見的RNA沈(chen)澱將(jiang)在管(guan)底(di)部(bu)和(he)側壁(bi)上(shang)形(xing)成(cheng)膠(jiao)狀(zhuang)沈(chen)澱塊。
④RNA清洗(xi) 移(yi)去(qu)上(shang)清(qing)液(ye)，每mlTRIZOL試(shi)劑裂(lie)解(jie)的(de)樣(yang)品(pin)中(zhong)加入(ru)至(zhi)少(shao)ml的75%yi醇(chun)(75%yi醇(chun)用(yong)DEPCH2O配制(zhi))，清(qing)洗(xi)RNA沈(chen)澱。混(hun)勻(yun)後，4℃下7000rpm離(li)心5分(fen)鐘。
⑤RNA幹(gan)燥(zao) 小心吸去(qu)大(da)部(bu)分(fen)yi醇(chun)溶液(ye)，使RNA沈(chen)澱在(zai)室(shi)溫空(kong)氣(qi)中(zhong)幹(gan)燥(zao)5-0分(fen)鐘。
⑥溶(rong)解(jie)RNA沈(chen)澱 溶(rong)解(jie)RNA時(shi)，先(xian)加入(ru)無(wu)RNA酶(mei)的水40μl用槍(qiang)反(fan)復(fu)吹打(da)幾次(ci)，使其(qi)*溶(rong)解(jie)，獲得(de)的RNA溶液(ye)保存(cun)於-80℃待(dai)用。 )紫(zi)外吸收法測定(ding)先用稀釋用的(de)TE溶液(ye)將(jiang)分(fen)光(guang)光(guang)度計調(tiao)零(ling)。然後取少(shao)量RNA溶(rong)液(ye)用TE稀釋(:00)後，讀(du)取(qu)其(qi)在(zai)分(fen)光(guang)光(guang)度計260nm和(he)280nm處(chu)的(de)吸(xi)收值，測定(ding)RNA溶液(ye) 濃(nong)度和(he)純度。