總RNA提(ti)取(qu)實(shi)驗(yan)

總RNA提(ti)取(qu)可以：（）獲(huo)得(de)高(gao)純(chun)度、高(gao)質量(liang)的(de)總RNA；（2）可以滿(man)足生物(wu)學(xue)下(xia)遊(you)實(shi)驗(yan)NorthernBlot、核(he)酸(suan)酶(mei)保護實(shi)驗(yan)、RT-PCR、qRT-PCR 和陣(zhen)列分析所(suo)需。
實(shi)驗(yan)方法(fa)原(yuan)理(li) 總RNA 提(ti)取(qu)試劑盒(he)，可(ke)以用(yong)來制(zhi)備(bei)高(gao)質量(liang)的(de)可(ke)用(yong)於建(jian)庫(ku)的(de)RNA 。該總RNA 純(chun)化系統采用(yong)兩種(zhong)的(de)RNA酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑(ji)，異硫(liu)氰酸弧(hu)（GTC）和β-巰基乙醇，加(jia)上整個(ge)操作(zuo)都在(zai)冰(bing)浴(yu)下(xia)進(jin)行，這樣(yang)就(jiu)能顯(xian)著(zhu)降(jiang)低RNA 的(de)降(jiang)解速(su)率。

GTC和N-十(shi)二烷基肌(ji)氨(an)酸(suan)鈉(na)的(de)聯合(he)使(shi)用(yong)，將促使(shi)核(he)蛋白(bai)復合(he)體(ti)的解離，使(shi)RNA 與(yu)蛋白(bai)質分離，並將RNA釋(shi)放(fang)到(dao)溶液(ye)中(zhong)。而(er)進(jin)壹步從復合(he)體(ti)中(zhong)純(chun)化RNA ，則根(gen)據(ju)Chomczynski和Sacchi的(de)壹步快速(su)抽(chou)提(ti)法(fa)進(jin)行，采用(yong)酸(suan)性酚-氯(lv)仿(fang)混合(he)液抽(chou)提(ti)。低(di)pH值的(de)酚將使(shi)RNA進(jin)入水(shui)相(xiang)，這樣(yang)使(shi)其與仍留在(zai)有機(ji)相(xiang)中(zhong)的(de)蛋白(bai)質和DNA分離。水(shui)相(xiang)中(zhong)的(de)RNA 可用(yong)異丙(bing)醇沈(chen)澱(dian)濃(nong)縮。進(jin)壹步將上述RNA沈(chen)澱(dian)復(fu)溶(rong)於GTC溶(rong)液(ye)中(zhong)，接(jie)著用(yong)異丙(bing)醇進(jin)行二次(ci)沈(chen)澱(dian)，隨(sui)後用(yong)乙醇洗(xi)滌(di)沈澱(dian)，即(ji)可(ke)去(qu)除(chu)所(suo)有(you)殘(can)留的蛋白(bai)質和無機鹽(yan)，而(er)RNA 中(zhong)如(ru)含(han)無機鹽(yan)，則有(you)可能對(dui)以後操作(zuo)中(zhong)的(de)壹些(xie)酶促反應產生抑(yi)制(zhi)。
實(shi)驗(yan)材料(liao) 微生物(wu) 動(dong)物(wu)細(xi)胞 植(zhi)物(wu)組(zu)織
試(shi)劑(ji)、試劑(ji)盒(he) RNA 提(ti)取(qu)試劑盒(he) 焦(jiao)碳(tan)酸(suan)二(er)乙酯 乙醇
儀器、耗材 恒溫水(shui)浴(yu) 冷凍(dong)高(gao)速(su)離心機 紫外分光(guang)光(guang)度(du)計(ji) 取液器 電(dian)泳儀 電(dian)泳槽
 

實(shi)驗(yan)步驟 壹(yi)、細(xi)胞或組(zu)織破(po)碎(sui)

. 微生物(wu)材料(liao)

（）發(fa)酵(jiao)3-4天(tian)（或對(dui)數(shu)生）的(de)菌體(ti)，離心收集菌絲體(ti)（動植(zhi)物(wu)材料(liao)無需此(ci)步處理(li)）。

（2）用(yong)經(jing)DEPC處(chu)理(li)的水(shui)洗(xi)菌絲體(ti)2-3次(ci)，並盡(jin)量(liang)除(chu)去(qu)殘存(cun)的(de)水(shui)。

（3）加(jia)液氮充分研磨，使(shi)其成為粉末(mo)，以釋(shi)放(fang)RNA。

（4）研(yan)磨後的樣(yang)品(pin)轉(zhuan)移至(zhi)2 ml變性液的(de)容(rong)器中(zhong)勻漿。

2. 動植(zhi)物(wu)細(xi)胞培(pei)養(yang)材料(liao) （適(shi)用(yong)的(de)樣(yang)品(pin)量(liang)為細胞：08）

（）細(xi)胞或組(zu)織培(pei)養(yang)：按常(chang)規方法(fa)進(jin)行。

（2）深(shen)層懸浮(fu)培(pei)養(yang)細胞的(de)破(po)碎(sui)。

①細胞收(shou)集(ji)：含(han)壹(yi)定(ding)濃(nong)度的(de)細(xi)胞培(pei)養(yang)液置於無菌離心管中(zhong)，4℃，3 000 g離(li)心5分鐘。

②細(xi)胞洗(xi)滌(di)：上步沈澱(dian)用(yong)25毫升(sheng)滅菌後冰(bing)凍(dong)的×PBS緩(huan)沖(chong)液洗(xi)滌(di)，然後4℃，3 000 g離心5分鐘。

③細(xi)胞破(po)碎(sui)：在(zai)沈澱(dian)細(xi)胞中(zhong)加(jia)入5 ml預(yu)冷的變性液，用(yong)無菌處理(li)過(guo)的勻漿器勻漿。

3. 表(biao)面培(pei)養(yang)細胞的(de)破(po)碎(sui)

（）確(que)定培(pei)養(yang)瓶(ping)數(shu)量，使(shi)選(xuan)定的各(ge)培(pei)養(yang)瓶(ping)細(xi)胞累(lei)加(jia)後總量達08。

（2）細胞收(shou)集(ji)：將培(pei)養(yang)液倒掉，用(yong)預(yu)冷(leng)的無菌PBS緩(huan)沖(chong)液洗(xi)滌(di)壹次(ci)，在(zai)培(pei)養(yang)瓶(ping)中(zhong)加(jia)入8 ml預(yu)冷變性液，轉(zhuan)動培(pei)養(yang)瓶(ping)，使(shi)細(xi)胞溶(rong)解，此時可(ke)見(jian)粘(zhan)度加(jia)大。

（3）用(yong)無菌吸管將*個培(pei)養(yang)瓶(ping)中(zhong)的(de)液體(ti)吸入第二個(ge)培(pei)養(yang)瓶(ping)，旋(xuan)轉(zhuan)，溶解細胞，再吸入第三(san)個培(pei)養(yang)瓶(ping)，以此(ci)類(lei)推(tui)，直(zhi)到(dao)將所(suo)選(xuan)定(ding)的培(pei)養(yang)瓶(ping)全部洗(xi)滌(di)壹次(ci)，然(ran)後從*個培(pei)養(yang)瓶(ping)開(kai)始(shi)再加入4毫升(sheng)上述變(bian)性液，將所(suo)有(you)培(pei)養(yang)瓶(ping)洗(xi)壹(yi)次(ci)。

（4）將上述2 ml含(han)細(xi)胞的(de)變(bian)性液轉(zhuan)移至(zhi)壹50毫升(sheng)無菌離心管中(zhong)，勻漿破(po)碎(sui)細胞。

3. 植(zhi)物(wu)組(zu)織破(po)碎(sui) （適用(yong)的(de)樣(yang)品(pin)量(liang)為0.05 g組(zu)織）

（）將600 ul變性液置於.5 ml離(li)心管中(zhong)，將此離(li)心管放於冰(bing)浴(yu)中(zhong)5分鐘。

（2）將0.05 g新鮮(xian)組(zu)織用(yong)液(ye)氮冰(bing)凍(dong)。

（3）在(zai)液氮下(xia)，研(yan)磨組(zu)織塊(kuai)。

（4）待(dai)液(ye)氮揮發後，將上述分散的組(zu)織轉(zhuan)移至(zhi)無菌離心管中(zhong)。

4. 動(dong)物(wu)組(zu)織破(po)碎(sui) （適用(yong)的(de)樣(yang)品(pin)量(liang)為 g 組(zu)織）

（）將2 ml變性液置於50 ml離(li)心管中(zhong)，將此離(li)心管放於冰(bing)浴(yu)中(zhong)5分鐘。

（2）在(zai)上述管(guan)中(zhong)加(jia)入 g新(xin)鮮或冰(bing)凍(dong)動物(wu)組(zu)織，勻漿粉碎(sui)。

二、RNA 的(de)抽(chou)提(ti)

（） 在(zai)經變(bian)性液勻漿的細(xi)胞或組(zu)織600 ul＋60 ul pH4.0的(de)2 M 乙酸鈉*混(hun)勻，可用(yong)漩(xuan)渦(wo)振(zhen)蕩(dang)器。

（2）600 ul酚\氯仿(fang)\異戊醇（25\24\），*混(hun)勻或漩渦(wo)振(zhen)蕩(dang)器振(zhen)蕩(dang)0秒(miao)。

（3）冰(bing)裕中(zhong)0-5分鐘，離(li)心，4℃，0 000 g，20分鐘。

（4）上層水(shui)相(xiang)吸至無菌離心管中(zhong)+等(deng)體(ti)積(ji)的異丙(bing)醇，-70℃，30分鐘沈(chen)澱(dian)RNA。

（5）離(li)心4℃，0 000g，20分鐘。

（6）沈(chen)澱(dian)RNA ，冷(leng)凍(dong)幹燥5分鐘 ， RNA 沈(chen)澱(dian)重新(xin)溶(rong)於300 ul變(bian)性液中(zhong)，可(ke)振(zhen)蕩(dang)（有(you)時為了幫助(zhu)溶(rong)解，可在(zai)65℃加熱(re)，但(dan)時間(jian)應極(ji)短(duan)）。

（7） 60 ul pH4.0的2M乙酸鈉*混(hun)勻，可用(yong)漩(xuan)渦(wo)振(zhen)蕩(dang)器。

（8） 600 ul酚\氯仿(fang)\異戊醇（25\24\），*混(hun)勻或漩渦(wo)振(zhen)蕩(dang)器振(zhen)蕩(dang)0秒(miao)。

（9） 冰(bing)裕中(zhong)0-5分鐘，離(li)心，4℃，0 000 g，20分鐘。

（0）上層水(shui)相(xiang)吸至無菌離心管中(zhong)。

（） 等(deng)體(ti)積(ji)異丙(bing)醇二(er)次(ci)沈(chen)澱(dian)（-70℃，30分鐘），75%乙醇洗(xi)沈(chen)澱(dian)，沈(chen)澱(dian)冷(leng)凍(dong)幹燥，復(fu)溶於去(qu)RNA 酶的水(shui)中(zhong)（對(dui)於準(zhun)備保存(cun)的(de)RNA 可加入pH 5.0的(de)乙酸鈉至(zhi)終(zhong)濃(nong)度為0.25 M，再加入2.5體(ti)積(ji)的乙醇，-70℃保存(cun)。）。