感受態細胞(bao)制(zhi)備實(shi)驗(yan)

壹、CaCl₂ 感(gan)受(shou)態(tai)細胞(bao)的(de)制(zhi)備的(de)實(shi)驗(yan)步驟

．前(qian)夜接(jie)種受體(ti)菌（ DH5α或 DH0B），挑取(qu)單(dan)菌落(luo)於LB培(pei)養基中(zhong)37℃搖床培養(yang)過(guo)夜(ye)（約6小時(shi)）；

2．取 ml過(guo)夜(ye)培(pei)養(yang)物(wu)轉接(jie)於00ml LB培養基中(zhong)，在37℃搖床(chuang)上劇(ju)烈振蕩培(pei)養約2.5-3小時(shi)（250-300rpm）；

3．將(jiang) 0.M CaCl₂ 溶液置(zhi)於冰(bing)上(shang)預(yu)冷(leng)；

以(yi)下(xia)步驟需(xu)在超凈(jing)工作(zuo)臺(tai)和(he)冰(bing)上(shang)操作

4．吸取 .5ml培養好(hao)的(de)菌(jun)液至(zhi).5ml離(li)心(xin)管中(zhong)，在冰(bing)上(shang)冷(leng)卻(que)0分鐘(zhong)；

5．4℃下(xia)3000g冷(leng)凍離(li)心(xin)5分鐘(zhong)；

6．棄(qi)去(qu)上清(qing)，加入(ru) 00μl預(yu)冷(leng)0.M CaCl₂ 溶(rong)液，用(yong)移(yi)液槍(qiang)輕(qing)輕(qing)上下吸(xi)動(dong)打勻，使細胞(bao)重(zhong)新(xin)懸浮，在冰(bing)放(fang)置(zhi)20分鐘(zhong)；

7．4℃下(xia)3000g冷(leng)凍離(li)心(xin)5分鐘(zhong)；

8．棄(qi)去(qu)上清(qing)，加入(ru) 00μl預(yu)冷(leng)0.M CaCl₂ 溶(rong)液，用(yong)移(yi)液槍(qiang)輕(qing)輕(qing)上下吸(xi)動(dong)打勻，使細胞(bao)重(zhong)新(xin)懸浮；

9．細胞(bao)懸浮液可立(li)即(ji)用於(yu)轉化(hua)實(shi)驗或添加(jia)冷(leng)凍保護劑(ji)（ 5% - 20%甘(gan)油(you)）後(hou)超低(di)溫冷(leng)凍貯存(cun)備用(yong)（－70℃）。

二(er)、電轉化(hua)法(fa)制(zhi)備大(da)腸(chang)桿(gan)菌(jun)感受態細胞(bao)的(de)實(shi)驗(yan)步驟

．前(qian)夜接(jie)種受體(ti)菌（ DH5α或 DH0B），挑取(qu)單(dan)菌落(luo)於LB培(pei)養基中(zhong)37℃搖床培養(yang)過(guo)夜(ye)；

2．取(qu) 2ml過(guo)夜(ye)培(pei)養(yang)物(wu)轉接(jie)於200ml LB培養基中(zhong)，在37℃搖床(chuang)上劇(ju)烈振蕩培(pei)養至(zhi)OD600 =0.6（約2.5-3小時(shi)）；

3．將(jiang)菌液迅(xun)速(su)置(zhi)於冰(bing)上(shang)。以(yi)下(xia)步驟務必在超凈(jing)工作(zuo)臺(tai)和(he)冰(bing)上(shang)操作

4．吸取 .5ml培養好(hao)的(de)菌(jun)液至(zhi).5ml離(li)心(xin)管中(zhong)，在冰(bing)上(shang)冷(leng)卻(que)0分鐘(zhong)；

5．4℃下(xia)3000g冷(leng)凍離(li)心(xin)5分鐘(zhong)；

6．棄(qi)去(qu)上清(qing)，加入(ru) 500μl冰(bing)冷(leng)的(de)0%甘(gan)油(you)，用(yong)移(yi)液槍(qiang)輕(qing)輕(qing)上下吸(xi)動(dong)打勻，使細胞(bao)重(zhong)新(xin)懸浮；

7．4℃下(xia)3000g冷(leng)凍離(li)心(xin)5分鐘(zhong)

8．棄(qi)去(qu)上清(qing)，加入(ru) 750μl冰(bing)冷(leng)的(de)0%甘(gan)油(you)，用(yong)移(yi)液槍(qiang)輕(qing)輕(qing)上下吸(xi)動(dong)打勻，使細胞(bao)重(zhong)新(xin)懸浮；

9．4℃下(xia)3000g冷(leng)凍離(li)心(xin)5分鐘(zhong)

0．加(jia)入(ru) 20μl冰(bing)冷(leng)0%的(de)甘(gan)油(you)，用(yong)移(yi)液器輕(qing)輕(qing)上下吸(xi)動(dong)打勻，使細胞(bao)重(zhong)新(xin)懸浮；

．立(li)即(ji)使用(yong)或迅速(su)置(zhi)於 -70℃超(chao)低(di)溫保存(cun)。

附註(zhu)：

影(ying)響感(gan)受態細胞(bao)轉(zhuan)化(hua)效率(lv)的(de)因素(su)及(ji)實際(ji)操作過(guo)程中(zhong)應註(zhu)意(yi)的(de)事(shi)項(xiang)：

．細菌(jun)的(de)生(sheng)長(chang)狀態(tai)：實(shi)驗中(zhong)應密切(qie)註(zhu)視(shi)細菌(jun)的(de)生(sheng)長(chang)狀態(tai)和(he)密度(du)，盡量(liang)使(shi)用對數生(sheng)的(de)細胞(bao)（壹(yi)般(ban)通(tong)過(guo)檢測OD600 來(lai)控(kong)制(zhi)。DH5α菌株 OD600 為 0.5 時(shi)細胞(bao)密(mi)度(du)是(shi) 5 × 0⁷ /ml ）；

2．所(suo)有(you)操(cao)作均(jun)應(ying)在無菌條件(jian)和(he)冰(bing)上(shang)進行；

3．經(jing) CaCl₂ 處理(li)的(de)細胞(bao)，在低溫條件(jian)下(xia)，壹(yi)定的(de)時(shi)間內(nei)轉(zhuan)化(hua)率(lv)隨時(shi)間的(de)推移而(er)增加， 24小時(shi)達到(dao)zui高(gao)，之(zhi)後(hou)轉化(hua)率(lv)再(zai)下(xia)降(jiang)（這是由於總(zong)的(de)活(huo)菌(jun)數(shu)隨時(shi)間延長(chang)而(er)減(jian)少(shao)造成的(de)）；

4．化(hua)合(he)物及(ji)無機離子(zi)的(de)影(ying)響(xiang)：在 Ca ²⁺ 的(de)基礎上(shang)聯合其他二價(jia)金(jin)屬離子(zi)（如 Mn ²⁺ 或 Co ²⁺ ）、 DMSO 或還原劑(ji)等物質(zhi)處理(li)細菌(jun)，可使轉化(hua)效率(lv)大(da)大(da)提(ti)高(gao)（ 00-000 倍(bei)）；

5．所使(shi)用的(de)器皿(min)必須幹(gan)凈。跡(ji)量的(de)去(qu)汙劑(ji)或其它(ta)化(hua)學(xue)物(wu)質(zhi)的(de)存(cun)在可能(neng)大(da)大(da)降(jiang)低(di)細菌(jun)的(de)轉(zhuan)化(hua)效率(lv)；

6．質(zhi)粒(li)的(de)大(da)小及(ji)構(gou)型(xing)的(de)影(ying)響(xiang)：用(yong)於(yu)轉化(hua)的(de)應(ying)主要(yao)是(shi)超螺(luo)旋(xuan)的(de) DNA ；

7．壹(yi)定(ding)範圍(wei)內(nei)，轉(zhuan)化(hua)效率(lv)與外源(yuan) DNA 的(de)濃(nong)度(du)呈(cheng)正(zheng)比(bi)。

詳情(qing)請看：感受態細胞(bao)制(zhi)備實(shi)驗(yan)