同種反應(ying)性(xing)Th和CTL克隆(long)的制(zhi)備(bei)

 

同(tong)種反應(ying)性(xing)是(shi)指未免(mian)疫的鼠(shu)或(huo)人T細胞(bao)對(dui)同(tong)種異體(ti)細胞(bao)上組(zu)織相容(rong)性抗原的反應(ying)。盡(jin)管同種反應(ying)性(xing)T細胞(bao)克隆(long)可(ke)從(cong)未免(mian)疫的脾(pi)細胞(bao)或淋巴細胞(bao)制(zhi)備(bei)，但(dan)經同(tong)種抗原預刺(ci)激(ji)的細胞(bao)所獲反應(ying)細胞(bao)的頻率較高(gao)。細胞(bao)毒性(xing)和非細胞(bao)毒性(xing)T細胞(bao)可經(jing)有(you)限稀(xi)釋進行克隆(long)。

 

材(cai)料與(yu)試(shi)劑

 

. 同(tong)種反應(ying)性(xing)鼠(shu)脾(pi)T細胞(bao)；

 

2. 以2000rad照射的同種鼠(shu)脾(pi)細胞(bao)作為刺(ci)激(ji)細胞(bao)。

 

3. 細胞(bao)培養(yang)所需的試(shi)劑和設備(bei)

 

4. 條件培養(yang)液（條(tiao)件液）的制(zhi)備(bei)

 

除了(le)重(zhong)組淋巴因子(zi)可(ke)用於(yu)T細胞(bao)克隆(long)外(wai)，各(ge)種類型(xing)的條件培養(yang)液均(jun)可(ke)作(zuo)為T細胞(bao)克隆(long)的生長(chang)因子(zi)（T cell growth factors， TCGF）。不(bu)同的條件培養(yang)液含(han)有(you)不同(tong)的淋巴因子(zi)。ConA誘(you)導的細胞(bao)培養(yang)上清(qing)含(han)有(you)大量(liang)的IL-2，但(dan)IL-4和IFN-γ的含(han)量(liang)較(jiao)低，而繼(ji)發MLC培養(yang)上清(qing)含(han)高(gao)水平IFN-γ，IL-2。PMA（TPA）激(ji)活(huo)的EL-4腫(zhong)瘤細胞(bao)上清(qing)（EL-4上(shang)清(qing)）含(han)IL-2。由此可(ke)根(gen)據不同(tong)的克隆(long)選(xuan)用不同(tong)的條件培養(yang)液。

 

① ConA誘(you)導的細胞(bao)培養(yang)上清(qing)（ConA上(shang)清(qing)）：於(yu)24孔培養(yang)板孔中(zhong)加入(ru).25×06/ml鼠(shu)脾(pi)細胞(bao)和2.5μg ConA，置(zhi)37℃5%CO2 溫(wen)箱(xiang)培養(yang)24～48h，離心(xin)收(shou)集上清(qing)，以CTLL-2或(huo)HT-2細胞(bao)檢測(ce)其(qi)IL-2含(han)量(liang)，分裝，置(zhi)-70℃保存備(bei)用。

 

② 繼(ji)發MLC培養(yang)上清(qing)：取(qu)C57BL/6鼠(shu)脾(pi)細胞(bao)2.5×07 （反應(ying)細胞(bao)）與(yu)等(deng)量(liang)經(jing)過(guo)照射（2000rad）的DBA/2鼠(shu)脾(pi)細胞(bao)（刺(ci)激(ji)細胞(bao)）在(zai)20ml培養(yang)液中(zhong)混(hun)合，置(zhi)37℃，5%CO2溫(wen)箱(xiang)培養(yang)0～4d，作為原代MLC。離(li)心(xin)收(shou)集原代MLC細胞(bao)，用培養(yang)液洗(xi)次(ci)。取(qu)6×06 原代細胞(bao)與(yu)2.5×07 經(jing)過(guo)照射的脾(pi)細胞(bao)混合(he)，同(tong)上(shang)述條(tiao)件培養(yang)36h，收集培養(yang)上清(qing)，置(zhi)-70℃保存備(bei)用。細胞(bao)作為以下(xia)試(shi)驗用的繼(ji)發MLC細胞(bao)。

 

③ EL-4上清(qing)的制(zhi)備(bei)：於(yu)24孔板加入(ru)06 /ml EL-4鼠(shu)淋巴瘤(liu)細胞(bao)和20ng PMA，培養(yang)4h。收集細胞(bao)，以培養(yang)液洗(xi)3次(ci)，加入(ru)培養(yang)液後(hou)繼(ji)續(xu)培養(yang)36h。收集上清(qing)，置(zhi)-70℃保存備(bei)用。

 

操作(zuo)步(bu)驟(zhou)

 

. 於(yu)96孔培養(yang)板孔中(zhong)加入(ru)06 /00μl經(jing)過(guo)照射的同種脾(pi)細胞(bao)。

 

2. 取(qu)繼(ji)發MLC細胞(bao)，用含(han)ConA或(huo)MLC上(shang)清(qing)的培養(yang)液作(zuo)有(you)限稀(xi)釋至(zhi)～0個(ge)細胞(bao)/ml，於(yu)步(bu)驟(zhou)（）板孔中(zhong)加入(ru)50μl細胞(bao)懸(xuan)液。培養(yang)4d後各(ge)孔加入(ru)50μl ConA或(huo)MLC上(shang)清(qing)和50μl培養(yang)液。繼(ji)續(xu)培養(yang)7～0d。

 

3. 用5Cr釋放(fang)試(shi)驗測(ce)定(ding)細胞(bao)毒活(huo)性(xing)，以篩(shai)選(xuan)同(tong)種反應(ying)CTL與(yu)Th。若(ruo)細胞(bao)毒試(shi)驗陰(yin)性，可以增殖(zhi)試(shi)驗測(ce)定(ding)Th活(huo)性(xing)。亦(yi)可(ke)通過(guo)IL-2、IL-4的產生或CD4、CD8的表(biao)達(da)進行篩選(xuan)。

 

4. 鑒定(ding)同種反應(ying)性(xing)T細胞(bao)的特征，如細胞(bao)毒活(huo)性(xing)、增殖(zhi)反應(ying)或(huo)某(mou)些(xie)淋巴因子(zi)的分泌等。

 

5. 克隆(long)細胞(bao)的維(wei)持:將2.5×04 ～×05 細胞(bao)轉種24孔培養(yang)板孔中(zhong)，同(tong)時加入(ru)×06 經(jing)過(guo)照射的同種脾(pi)細胞(bao)和含(han)條(tiao)件液的培養(yang)液，每(mei)周(zhou)傳(chuan)代(dai)壹次(ci)。