ROS的流式(shi)檢測(ce)

詳(xiang)情請(qing)看(kan)：ROS的流式(shi)檢測(ce)

 活(huo)性氧(yang)檢(jian)測(ce)試劑盒(he)（Reactive oxygen species assay kit）是壹種利用熒(ying)光(guang)探(tan)針DCFH-DA進行活(huo)性氧(yang)檢(jian)測(ce)的試劑盒(he)。DCFH-DA本身沒(mei)有(you)熒光(guang)，可(ke)以(yi)自由(you)穿(chuan)過細(xi)胞膜(mo)，進入(ru)細(xi)胞內後，可以(yi)被(bei)細(xi)胞內的酯酶水解(jie)生成DCFH。而DCFH不(bu)能(neng)通(tong)透細(xi)胞膜(mo)，從而(er)使探(tan)針很容易(yi)被裝(zhuang)載(zai)到(dao)細(xi)胞內。細(xi)胞內的活(huo)性氧(yang)可(ke)以(yi)氧(yang)化無(wu)熒(ying)光(guang)的DCFH生成有熒光(guang)的DCF。檢測(ce)DCF的熒光(guang)就(jiu)可(ke)以(yi)知(zhi)道細(xi)胞內活(huo)性氧(yang)的水平。 本試劑盒(he)提供了(le)活(huo)性氧(yang)陽(yang)性對照(zhao)試(shi)劑Rosup以(yi)便(bian)於(yu)活(huo)性氧(yang)的檢測(ce)。Rosup是壹種混(hun)合(he)物（compound mixture），濃度(du)為(wei)50mg/ml。

壹、註意事項

、探針裝(zhuang)載(zai)後，壹定(ding)要洗(xi)凈(jing)殘(can)余的未進入(ru)細(xi)胞內的探針，否(fou)則(ze)會導(dao)致背(bei)景(jing)較高(gao)。

2、探(tan)針裝(zhuang)載(zai)完畢(bi)並洗(xi)凈(jing)殘(can)余探針後，可以(yi)進行激(ji)發(fa)波(bo)長的掃描(miao)和(he)發(fa)射(she)波(bo)長的掃描(miao)，以(yi)確(que)認(ren)探針的裝載情況(kuang)是(shi)否良(liang)好(hao)。

3、盡量(liang)縮短(duan)探(tan)針裝(zhuang)載(zai)後到測(ce)定(ding)所用的時間（刺(ci)激(ji)時(shi)間(jian)除(chu)外），以(yi)減(jian)少各(ge)種可(ke)能(neng)的誤差。

4、為了(le)您的安全和(he)健(jian)康(kang)，請穿實驗服(fu)並戴壹次性手(shou)套操(cao)作。

二(er)、使用說明

、裝載探針

對(dui)於(yu)刺(ci)激(ji)時(shi)間(jian)較短（通(tong)常(chang)為(wei)2小(xiao)時(shi)以(yi)內）的細(xi)胞，先(xian)裝載(zai)探(tan)針，後用活(huo)性氧(yang)陽(yang)性對照(zhao)及(ji)自己感(gan)興(xing)趣(qu)的藥物刺(ci)激(ji)細(xi)胞。對(dui)於(yu)細(xi)胞刺(ci)激(ji)

時(shi)間(jian)較長（通常(chang)為(wei)6小(xiao)時(shi)以(yi)上）的細(xi)胞，先(xian)用活(huo)性氧(yang)陽(yang)性對照(zhao)及(ji)自己感(gan)興(xing)趣(qu)的藥物刺(ci)激(ji)細(xi)胞，後裝載探針。

原(yuan)位裝載(zai)探針：本(ben)方(fang)法(fa)僅適(shi)用於(yu)貼(tie)壁培(pei)養(yang)細(xi)胞。按照(zhao)：000用無(wu)血清(qing)培(pei)養(yang)液稀(xi)釋(shi)DCFH-DA，使終濃度(du)為(wei)0微摩(mo)爾/升。去除(chu)細(xi)胞培(pei)養(yang)液，加入適(shi)當(dang)體(ti)積(ji)稀釋(shi)好(hao)的DCFH-DA。加入的體(ti)積(ji)以(yi)能(neng)充分(fen)蓋住(zhu)細(xi)胞為(wei)宜，通常(chang)對(dui)於(yu)六(liu)孔板(ban)的壹個孔加入稀(xi)釋(shi)好(hao)的DCFH-DA的體(ti)積(ji)為毫(hao)升。37℃細(xi)胞培(pei)養(yang)箱(xiang)內孵育(yu)20分(fen)鐘(zhong)。用無(wu)血清(qing)細(xi)胞培(pei)養(yang)液洗(xi)滌(di)細(xi)胞三(san)次，以(yi)充分(fen)去除未(wei)進入(ru)細(xi)胞內的DCFH-DA。

通常(chang)活(huo)性氧(yang)陽(yang)性對照(zhao)在(zai)刺(ci)激(ji)細(xi)胞20-30分(fen)鐘(zhong)後可以(yi)顯(xian)著提(ti)高(gao)活(huo)性氧(yang)水平。

收(shou)集(ji)細(xi)胞後裝載探針：按照(zhao)：000用無(wu)血清(qing)培(pei)養(yang)液稀(xi)釋(shi)DCFH-DA，使終濃度(du)為(wei)0微摩(mo)爾/升。細(xi)胞收(shou)集(ji)後懸(xuan)浮(fu)於(yu)稀(xi)釋(shi)好(hao)的DCFH-DA中，細(xi)胞濃(nong)度(du)為(wei)壹百萬至二(er)千(qian)萬(wan)/毫(hao)升，37℃細(xi)胞培(pei)養(yang)箱(xiang)內孵育(yu)20分(fen)鐘(zhong)。每(mei)隔3-5分(fen)鐘(zhong)顛(dian)倒混(hun)勻(yun)壹下(xia)，使探(tan)針和(he)細(xi)胞充分(fen)接觸。用無(wu)血清(qing)細(xi)胞培(pei)養(yang)液洗(xi)滌(di)細(xi)胞三(san)次，以(yi)充分(fen)去除未(wei)進入(ru)細(xi)胞內的DCFH-DA。直接用活(huo)性氧(yang)陽(yang)性對照(zhao)及(ji)自己感(gan)興(xing)趣(qu)的藥物刺(ci)激(ji)細(xi)胞，或(huo)把細(xi)胞等(deng)分(fen)成若(ruo)幹(gan)份(fen)後刺激(ji)細(xi)胞。通(tong)常(chang)活(huo)性氧(yang)陽(yang)性對照(zhao)在(zai)刺(ci)激(ji)細(xi)胞20-30分(fen)鐘(zhong)後可以(yi)顯(xian)著提(ti)高(gao)活(huo)性氧(yang)水平。

2.、檢測(ce)

對於(yu)原(yuan)位裝載(zai)探針的樣(yang)品(pin)可(ke)以(yi)用激(ji)光(guang)共(gong)聚(ju)焦(jiao)顯微鏡直(zhi)接觀察，或(huo)收(shou)集(ji)細(xi)胞後用熒(ying)光(guang)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計、熒光(guang)酶(mei)標(biao)儀或(huo)流(liu)式(shi)細(xi)胞儀檢(jian)測(ce)。

對於(yu)收(shou)集(ji)細(xi)胞後裝載探針的樣(yang)品(pin)可(ke)以(yi)用熒(ying)光(guang)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計、熒光(guang)酶(mei)標(biao)儀或(huo)流(liu)式(shi)細(xi)胞儀檢(jian)測(ce)，用激(ji)光(guang)共(gong)聚(ju)焦(jiao)顯微鏡直(zhi)接觀察也(ye)可(ke)以(yi)。

3、參(can)數(shu)設置

使用488nm激(ji)發(fa)波(bo)長，525nm發射波長，實時或(huo)逐(zhu)時間(jian)點檢測(ce)刺激(ji)前後熒光(guang)的強弱。DCF的熒光(guang)光(guang)譜(pu)和(he)FITC非(fei)常(chang)相(xiang)似(si)，可(ke)以(yi)用FITC的參(can)數(shu)設置檢測(ce)DCF。DCF的激(ji)發(fa)光(guang)譜(pu)和(he)發(fa)射(she)光(guang)譜(pu)參(can)考下(xia)圖(tu)。

4、其它(ta)說明

陽性對照(zhao)可(ke)以(yi)按照(zhao)：000的比例使用。例如(ru)裝載好(hao)探針的細(xi)胞共(gong)毫(hao)升，可以(yi)加入微升的陽性對照(zhao)刺(ci)激(ji)。通(tong)常(chang)刺(ci)激(ji)後20-30分(fen)鐘(zhong)內可以(yi)觀(guan)察到(dao)非常(chang)顯(xian)著(zhu)的活(huo)性氧(yang)水平升高(gao)。對(dui)於(yu)不(bu)同(tong)的細(xi)胞，活(huo)性氧(yang)陽(yang)性對照(zhao)的效(xiao)果(guo)可能(neng)有(you)較大(da)的差別。如(ru)果(guo)在(zai)刺(ci)激(ji)後30分(fen)鐘(zhong)內觀察(cha)不(bu)到(dao)活(huo)性氧(yang)的升高(gao)，可(ke)以(yi)適(shi)當(dang)提(ti)高(gao)活(huo)性氧(yang)陽(yang)性對照(zhao)的濃度(du)。如(ru)果(guo)活(huo)性氧(yang)升高(gao)得過快，可(ke)以(yi)適(shi)當(dang)降(jiang)低(di)活(huo)性氧(yang)陽(yang)性對照(zhao)的濃度(du)。

另(ling)外(wai)，對(dui)於(yu)某(mou)些(xie)細(xi)胞，如(ru)果發現沒有刺激(ji)的陰(yin)性對照(zhao)細(xi)胞熒(ying)光(guang)也(ye)比較強，可(ke)以(yi)按照(zhao)：2000-：5000稀(xi)釋(shi)DCFH-DA，使裝(zhuang)載探(tan)針時(shi)DCFH-DA的濃度(du)為(wei)2-5微摩(mo)爾/升。探針裝(zhuang)載(zai)的時間也(ye)可(ke)以(yi)根(gen)據情況(kuang)在(zai)5-60分(fen)鐘(zhong)內適當(dang)進行調(tiao)整。