木絲(si)黴探針法(fa)熒光定(ding)量(liang)PCR試劑(ji)盒使用(yong)方法(fa)

木絲(si)黴(mei)探(tan)針法(fa)熒光定(ding)量(liang)PCR試劑(ji)盒使用(yong)方法(fa)：

測(ce)定法(fa)的靈(ling)敏(min)度(du)來自作為(wei)報(bao)告的酶。酶是壹(yi)種有(you)機(ji)催(cui)化劑(ji)，很少(shao)量(liang)的酶即可誘導大(da)量(liang)的催(cui)化反(fan)應(ying)，產生(sheng)可(ke)供(gong)觀察的顯色(se)反(fan)應(ying)現(xian)象。因(yin)此(ci)該體(ti)系常被(bei)稱為(wei)酶放(fang)大(da)體(ti)系。

1. 標(biao)準品的稀釋：本(ben)試劑(ji)盒提(ti)供(gong)原倍標(biao)準品壹(yi)支，用(yong)戶(hu)可按照(zhao)下列圖(tu)表(biao)在(zai)小試管中進行(xing)稀釋。   24μg/ml    5號(hao)標(biao)準品    150μl的原倍標(biao)準品加入150μl標(biao)準品稀釋液

 12μg/ml    4號(hao)標(biao)準品    150μl的5號(hao)標(biao)準品加入150μl標(biao)準品稀釋液

 6μg/ml     3號(hao)標(biao)準品    150μl的4號(hao)標(biao)準品加入150μl標(biao)準品稀釋液

 3μg/ml     2號(hao)標(biao)準品    150μl的3號(hao)標(biao)準品加入150μl標(biao)準品稀釋液

 1.5μg/ml   1號(hao)標(biao)準品    150μl的2號(hao)標(biao)準品加入150μl標(biao)準品稀釋液

2. 加樣(yang)：分(fen)別設空(kong)白孔、標(biao)準孔、待測(ce)樣(yang)品孔(kong)。在酶標(biao)包(bao)被板上標(biao)準品準確加樣(yang)50μl，待測(ce)樣(yang)品孔(kong)中先(xian)加樣(yang)品稀釋液40μl，然後再(zai)加待測(ce)樣(yang)品10μl（樣(yang)品終稀釋度為(wei)5倍）。加樣(yang)將(jiang)樣(yang)品加於(yu)酶標(biao)板孔(kong)底部，盡量(liang)不(bu)觸及(ji)孔(kong)壁(bi)，輕輕晃動(dong)混(hun)勻(yun)。|

3. 溫育：用(yong)封(feng)板膜(mo)封板後置(zhi)37℃溫(wen)育(yu)30分(fen)鐘。   

4. 配液(ye)：將(jiang)30倍濃(nong)縮(suo)洗(xi)滌(di)液(ye)用(yong)蒸(zheng)餾水30倍稀釋後備(bei)用(yong)

5. 洗(xi)滌：小心(xin)揭掉(diao)封(feng)板膜(mo)，棄去液(ye)體(ti)，甩(shuai)幹(gan)，每孔(kong)加滿洗(xi)滌(di)液，靜置30秒後棄去，如(ru)此(ci)重復5次(ci)，拍幹(gan)。

6. 加酶：每孔(kong)加入酶標(biao)試劑(ji)50μl，空(kong)白孔除(chu)外。

7. 溫(wen)育(yu)：操(cao)作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯色(se)：每孔(kong)先(xian)加入顯色(se)劑(ji)A50μl，再(zai)加入顯色(se)劑(ji)B50μl，輕(qing)輕(qing)震蕩(dang)混(hun)勻(yun)，37℃避光顯色(se)15分(fen)鐘.

10. 終止：每孔(kong)加終止液50μl，終止反應（此(ci)時藍(lan)色(se)立(li)轉(zhuan)黃(huang)色(se)）。

11. 測(ce)定：以(yi)空(kong)白空(kong)調零(ling)，450nm波長(chang)依(yi)序測(ce)量(liang)各孔(kong)的吸(xi)光(guang)度(du)（OD值(zhi)）。 測(ce)定應(ying)在加終止液後15分(fen)鐘以(yi)內(nei)進行(xing)。