莽(mang)草(cao)酸脫氫(qing)酶(mei)(SD)測試盒實(shi)驗(yan)操(cao)作流程(cheng)

莽(mang)草酸脫氫(qing)酶(mei)(SD)測試盒操(cao)作步驟

1. 樣本預(yu)處理(li)

取(qu)0.2g新鮮植物(wu)組(zu)織置於預(yu)冷(leng)的研缽中(zhong)，加入1.5mL 0.1M磷(lin)酸緩沖(chong)液(ye)（pH7.5）冰浴研磨(mo)，4℃條件(jian)下(xia)12000rpm離(li)心(xin)15分(fen)鐘(zhong)，上清液(ye)即為粗(cu)酶(mei)提取(qu)液。註意(yi)：所有(you)操(cao)作需在(zai)冰上完成(cheng)，避免酶(mei)活性(xing)損失(shi)。

2. 反(fan)應(ying)體(ti)系構(gou)建(jian)

在(zai)1.5mL離心(xin)管(guan)中(zhong)依次(ci)加入：

- 650μL 0.1M Tris-HCl緩沖(chong)液(ye)（pH8.0）

- 100μL 10mM NAD+

- 50μL 粗(cu)酶(mei)提取(qu)液

輕輕混(hun)勻(yun)後(hou)37℃水(shui)浴預(yu)熱(re)5分(fen)鐘(zhong)，設置空白對(dui)照組(zu)（用緩沖(chong)液(ye)替(ti)代(dai)酶液）。

3. 反(fan)應(ying)啟動與(yu)監(jian)測

加入200μL 20mM莽(mang)草(cao)酸溶液啟動反(fan)應(ying)，立即轉(zhuan)移至分(fen)光(guang)光度(du)計比(bi)色皿。在(zai)340nm波(bo)長(chang)下(xia)，每(mei)30秒(miao)記錄(lu)壹(yi)次(ci)吸光(guang)度(du)值(zhi)，持續監(jian)測(ce)10分(fen)鐘(zhong)。建(jian)議(yi)使用帶(dai)恒(heng)溫裝置的分(fen)光(guang)光度(du)計保持37℃測定環(huan)境(jing)。

4. 關鍵註意(yi)事(shi)項

（1）反(fan)應(ying)線(xian)性(xing)期判(pan)定：選擇OD值(zhi)變(bian)化(hua)呈直(zhi)線(xian)的時間段(duan)（通(tong)常(chang)為(wei)前(qian)4分(fen)鐘(zhong)）計算(suan)酶(mei)活，R²應(ying)＞0.98；

（2）幹(gan)擾(rao)排除(chu)：若樣本含(han)色素(su)，需增(zeng)設(she)不(bu)加NAD+的對(dui)照管(guan)扣(kou)除(chu)本底(di)；

（3）酶活計算(suan)：ΔA/min×反(fan)應(ying)體(ti)系總(zong)體(ti)積(ji)（μL）×稀釋倍數(shu)/（6.22×光(guang)程(cheng)cm×取(qu)樣量μL），結(jie)果(guo)以U/g FW表(biao)示。

【常(chang)見(jian)問題(ti)解(jie)決(jue)方案】

- 反(fan)應(ying)速(su)率(lv)過(guo)低：檢查(zha)NAD+試劑是(shi)否(fou)失(shi)效(xiao)，或嘗試提高(gao)酶(mei)液濃(nong)度(du)；

- 曲(qu)線(xian)非線(xian)性(xing)：可能(neng)樣本中(zhong)代(dai)謝物幹(gan)擾(rao)，建(jian)議(yi)超(chao)濾(lv)純化(hua)酶(mei)液；

- 數(shu)據波(bo)動(dong)大：確認比(bi)色皿清潔(jie)度(du)，避免氣(qi)泡幹(gan)擾(rao)。