細(xi)胞培養(yang)基(ji)制備(bei)原(yuan)材料需要及(ji)裂(lie)解(jie)液(ye)的(de)制備(bei)

細胞培養(yang)基(ji)制備(bei)原(yuan)材料需要及(ji)裂(lie)解(jie)液(ye)的(de)制備(bei)

    細(xi)胞培養(yang)基(ji)的(de)制備(bei)工(gong)作涉(she)及(ji)物(wu)理、化(hua)學和(he)生物(wu)等(deng)各(ge)方(fang)面(mian)知識(shi)，但基(ji)本(ben)原理不外(wai)乎(hu)兩方(fang)面(mian)。壹(yi)是(shi)得用(yong)混(hun)合(he)物(wu)中(zhong)幾個(ge)組分(fen)分配(pei)率(lv)的(de)差別(bie)，把它(ta)們分(fen)配(pei)到(dao)可(ke)用(yong)機(ji)械方(fang)法分(fen)離(li)的(de)兩個(ge)或(huo)幾個(ge)物(wu)相中(zhong)，如(ru)鹽析(xi)，有機(ji)溶(rong)劑提取(qu)，層析(xi)和結(jie)晶等(deng)；二(er)是(shi)將(jiang)混(hun)合(he)物(wu)置(zhi)於(yu)單壹(yi)物(wu)相中(zhong)，通(tong)過(guo)物(wu)理力場的(de)作用使(shi)各(ge)組分分配(pei)於(yu)來同區(qu)域而(er)達(da)到分(fen)離(li)目的(de)，如(ru)電泳(yong)，超速(su)離(li)心(xin)，超(chao)濾(lv)等(deng)。在(zai)所(suo)有這(zhe)些方(fang)法的(de)應用中(zhong)必(bi)須註(zhu)意(yi)保(bao)存(cun)生物(wu)大分(fen)子的(de)完(wan)整(zheng)性，防(fang)止(zhi)酸(suan)、鹼、高(gao)溫，劇(ju)烈(lie)機(ji)械作用而(er)導致(zhi)所(suo)提物(wu)質(zhi)生物(wu)活(huo)性的(de)喪失。細胞(bao)培養(yang)基(ji)的(de)制備(bei)壹(yi)般(ban)分為以下四(si)個階段：選(xuan)擇材料和預(yu)處(chu)理，細胞的(de)破碎(sui)及(ji)細(xi)胞(bao)器的(de)分離(li)，提取(qu)和(he)純(chun)化(hua)，濃(nong)細(xi)、幹燥(zao)和(he)保(bao)存(cun)。

　　微(wei)生(sheng)物(wu)、植物(wu)和動(dong)物(wu)都(dou)可做為制(zhi)備(bei)細(xi)胞培養(yang)基(ji)的(de)原材料，所(suo)選(xuan)用(yong)的(de)材料主(zhu)要依(yi)據(ju)實(shi)驗目的(de)來確(que)定(ding)。對(dui)於(yu)微(wei)生(sheng)物(wu)，應註(zhu)意(yi)它(ta)的(de)生，在(zai)微(wei)生(sheng)物(wu)的(de)對(dui)數(shu)生，酶(mei)和(he)核酸(suan)的(de)含(han)量較(jiao)高(gao)，可以獲得高(gao)產量，以微(wei)生(sheng)物(wu)為材料時(shi)有(you)兩(liang)種情況：（）得用(yong)微(wei)生(sheng)物(wu)菌體(ti)分泌到培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)的(de)代(dai)謝產(chan)物(wu)和胞(bao)外(wai)酶(mei)等(deng)；（2）利(li)用(yong)菌(jun)體(ti)含(han)有的(de)生化(hua)物(wu)質(zhi)，如(ru)細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)基(ji)、核酸(suan)和胞(bao)內(nei)酶(mei)等(deng)。植(zhi)物(wu)材料必(bi)須經(jing)過(guo)去殼(ke)，脫(tuo)脂並(bing)註(zhu)意(yi)植物(wu)品種和生(sheng)長(chang)發育狀(zhuang)況(kuang)不同，其中(zhong)所(suo)含(han)生物(wu)大分(fen)子的(de)量變化(hua)很大(da)，另外(wai)與季(ji)節(jie)性關(guan)系密切(qie)。對(dui)動(dong)物(wu)組織(zhi)，必(bi)須選(xuan)擇有效(xiao)成份(fen)含(han)量豐富的(de)臟器組織為原(yuan)材料，先進行絞碎(sui)、脫脂等(deng)處(chu)理。另外(wai)，對(dui)預(yu)處(chu)理好(hao)的(de)材料，若不立即進行實(shi)驗，應冷凍(dong)保(bao)存(cun)，對(dui)於(yu)易分(fen)解(jie)的(de)生物(wu)大分(fen)子應選(xuan)用(yong)新鮮材料制備(bei)。

裂(lie)解液(ye)的(de)制備(bei)步(bu)驟(zhou)：

    、將(jiang)長(chang)滿細胞的(de)培養(yang)基(ji)瓶(ping)放置(zhi)在(zai)冰上，用吸液(ye)管吸出培養(yang)液(ye)。加入足(zu)夠的(de)冷的(de)PBS在培(pei)養(yang)瓶(ping)中(zhong)充分(fen)洗(xi)滌(di)細胞(bao)表面(mian)，以洗(xi)去(qu)瓶(ping)中(zhong)殘留(liu)的(de)培養(yang)基(ji)，倒(dao)掉PBS ，重(zhong)復(fu)以上操作2-3遍。在(zai)zui後壹(yi)次(ci)洗(xi)滌(di)中(zhong)盡可(ke)能(neng)吸(xi)幹殘留(liu)的(de)PBS，盡量在冰上操作。

　　2、向(xiang)培養(yang)瓶(ping)中(zhong)加入冷的(de)RIPA 裂解(jie)緩(huan)沖液(ye)(每75cm2 培(pei)養(yang)瓶(ping)加ml). 然(ran)後用細胞刮子(zi)沿(yan)著瓶(ping)壁(bi)開始刮細胞(bao)，如(ru)果所(suo)需要(yao)刮(gua)的(de)同種細胞(bao)有(you)多(duo)瓶(ping)，則(ze)將(jiang)*瓶(ping)刮下的(de)細胞(bao)液(ye)吸出轉入下壹(yi)瓶(ping)中(zhong)繼續(xu)刮(由於(yu)處(chu)理後的(de)細胞(bao)裂解(jie)液(ye)較(jiao)粘(zhan)稠(chou)，所(suo)以宜用直(zhi)徑(jing)大(da)點(dian)的(de)吸液(ye)管吸取)。

　　3、吸出刮好(hao)的(de)細胞(bao)裂解(jie)液(ye)置(zhi)於(yu)4ml 離(li)心(xin)管中(zhong)（置(zhi)於(yu)冰上），然後重(zhong)復(fu)步(bu)驟(zhou)2以刮取剩(sheng)下的(de)細胞(bao)。

　　4、盡可(ke)能(neng)將(jiang)多(duo)的(de)細胞(bao)培養(yang)基(ji)裂解液(ye)收集(ji)到(dao)4ml的(de)離(li)心(xin)管中(zhong)，樣品(pin)插入冰盒(he)進行超聲(sheng)，超聲(sheng)強(qiang)度以不產生泡(pao)沫(mo)為(wei)準，超(chao)聲(sheng)每次(ci)2-3秒(miao)，重(zhong)復(fu)3-4次(ci)。如(ru)仍(reng)有(you)細(xi)胞(bao)碎片(pian)或(huo)沈澱，應離(li)心(xin)0000rpm,0分(fen)鐘，留取(qu)上清。

　　5、取出小(xiao)量細胞裂解(jie)液(ye)測其蛋(dan)白濃(nong)度（用(yong)Biorad Bradford 試(shi)劑(ji)盒(he)或(huo)紫(zi)外(wai)分光(guang)光度計(ji)，在(zai)A280測定），分(fen)裝(zhuang)保(bao)存(cun)在-70℃。